Разработка и практическое применение методики для идентификации поверхностных антигенов Borrelia miyamotoi

Обложка


Цитировать

Полный текст

Аннотация

Введение. Borrelia miyamotoi — возбудитель безэритемной формы иксодового клещевого боррелиоза (ИКБ) — заболевания, широко распространённого в России. В геноме B. miyamotoi присутствуют гены десятков вариабельных основных поверхностных белков (Vmp). Vmp разделяют на два семейства — Vsp и Vlp (с подсемействами δ, γ, α и β). В конкретный момент времени отдельная B. miyamotoi экспрессирует единственный вариант гена Vmp.

Цель работы — создание методики для идентификации гена Vmp, находящегося в сайте экспрессии.

Материалы и методы. Методика реализована в формате мультиплексной ПЦР в режиме реального времени. Для её испытания были использованы образцы ДНК B. miyamotoi, выделенные из крови 172 больных ИКБ и 109 клещей. Образцы были собраны в 14 регионах России.

Результаты. Разработанная методика позволила идентифицировать экспрессирующийся Vmp в 82% исследованных проб, т.е. показала достаточную эффективность. Отрицательные результаты значимо реже наблюдались среди проб от больных, чем среди проб клещей. При этом доля проб с Vmp только одного типа одинакова среди клинических образцов и клещей, а доля проб, в которых детектируются одновременно два типа Vmp, значимо выше среди образцов от больных, где наиболее часто встречалась комбинация Vlp-δ и Vsp.

Обсуждение. Тот факт, что в образцах крови чаще выявляется сочетание двух типов Vmp, может говорить об одновременном присутствии нескольких субпопуляций B. miyamotoi в организме больных ИКБ. После того как к основному поверхностному белку штамма, занесённого клещом, вырабатываются протективные антитела, происходит переключение на синтез нового антигенного варианта Vmp. Такой феномен, называемый «иммунным избеганием», позволяет патогену персистировать в организме хозяина.

Заключение. Созданная методика мультиплексной ПЦР в режиме реального времени позволяет проводить одновременную детекцию нескольких антигенных вариантов вариабельных основных поверхностных белков B. miyamotoi. Изучение антигенного спектра штаммов B. miyamotoi в сопоставлении с характеристикой консервативных участков генома методом мультилокусного секвенирования позволит прояснить этапы эволюции и распространения B. miyamotoi sensu lato.

Полный текст

Введение

Borrelia miyamotoi — возбудитель безэритемной формы иксодового клещевого боррелиоза (ИКБ). Впервые культуры B. miyamotoi были получены из клеща Ixodes persulcatus (штамм HT31) и мыши Apodemus argenteus (штамм FR64b) в 1992 г. в Японии [1][2][3]. После обнаружения в 2003 г. сотрудниками ЦНИИ Эпидемиологии ДНК B. miyamotoi в крови больных с безэритемной формой ИКБ в Удмуртии активно изучаются биологические свойства возбудителя, особенности клинического течения и эпидемиологии ИКБ, вызванного B. miyamotoi (ИКББМ) [3–10].

Основная сложность при изучении патогенеза ИКБ-БМ долгое время состояла в невозможности культивировать B. miyamotoi из организма заболевшего человека, что затрудняло проведение полногеномного анализа и полноценную генетическую характеристику патогенов. Позже эта проблема была решена [11][12][13]; на момент начала данного исследования были доступны полные нуклеотидные последовательности хромосом и последовательности всех или некоторых плазмид 10 штаммов

B. miyamotoi: штамма FR64b, 3 штаммов CT13– 2396, CA17–2241 и LB-2001, выделенных из клещей на территории США [14][15], и 6 штаммов Izh-4, Izh-5, Izh-14, Izh-16, Yekat-1, Yekat-6, выделенных из крови пациентов с ИКБ-БМ на территории России [11][12][16][17]. B. miyamotoi экспрессируют вариабельные основные поверхностные белки (variable major protein, Vmp), к которым в восприимчивом организме в ходе инфекции вырабатываются IgM- и IgG-антитела, обладающие протективной активностью. На основании гомологии аминокислотных последовательностей Vmp разделяют на два семейства: Vlp (variable large proteins) и Vsp (variable small proteins) с размером приблизительно 330 и 200 аминокислот соответственно. Vlp подразделяют на 4 подсемейства или кластера: альфа (α), бета (β), гамма (γ) и дельта (δ). В российских штаммах было показано присутствие нескольких вариантов экспрессии Vmp и их сочетаний [14][17][18]. Далее мы упрощённо будем говорить об этих 5 вариантах белков (Vlp-δ, Vsp, Vlp-γ, Vlp-α и Vlp-β) как о типах Vmp. Отметим, что ранее некоторыми авторами первые 4 типа (или их представители) обозначались как Vlp15/16, Vsp1, Vlp5 и Vlp18 соответственно. Присутствие гена Vlp-β в геноме B. miyamotoi было впервые обнаружено в работе [17], он был назван нами по аналогии с гомологичным белком, экспрессируемым B. hermsii и другими возбудителями клещевых возвратных лихорадок. Среднее различие по аминокислотным последовательностям внутри типа Vmp составляет 20–40% [19], между типами — 55–80% (см., например, Fig. 4 и Fig. 5 в работе [17]).

Гены Vmp располагаются не на хромосоме, а на плазмидах, которых в геноме изученных штаммов B. miyamotoi имеется более десятка [17]. При этом считается, что в конкретный момент времени единичная боррелия экспрессирует только один ген Vmp, находящийся в сайте экспрессии в непосредственной близости от бактериального промотора. Но у неё есть «запас» генов Vmp (от 30 до 50), которые при определённых условиях могут заменить прежний в сайте экспрессии и тем самым изменить антигенные свойства штамма [14][17].

В эпидемиологии идентификация белка определённого класса, присущего конкретному штамму, позволяет проводить внутривидовую характеристику возбудителей, циркулирующих в разное время, на разных территориях и в разных источниках (резервуарах). Информация об антигенных свойствах возбудителей может быть потенциально использована в клинической практике для прогноза течения и исхода инфекционного процесса, а также для создания средств иммунопрофилактики — эффективного способа эпидемиологического контроля инфекционных заболеваний. Применительно к B. miyamotoi и другим боррелиям — возбудителям клещевых возвратных лихорадок и болезни Лайма — мишенью для антигенного типирования могут стать основные поверхностные белки.

Прямое серотипирование боррелий — возбудителей ИКБ-БМ пока мало информативно, поскольку выделено незначительное количество штаммов B. miyamotoi. Выявление антигенспецифических антител, продуцируемых в ходе заболевания, в принципе возможно [20][21], но требует создания набора антигенов, не производимых пока с коммерческими целями, и, в случае использования планарных белковых иммуночипов, дополнительного оборудования, которое отсутствует в большинстве диагностических лабораторий [7][22–26]. Кроме того, в некоторых случаях антитела к Vmp могут давать перекрёстные реакции, например антитела к Vlp-δ отчасти взаимодействуют с антигеном Vlp-γ, и наоборот.

Перспективным инструментом для характеристики антигенного разнообразия B. miyamotoi может быть использование основанных на ПЦР молекулярно-биологических методик, направленных на детекцию или секвенирование нуклеотидных последовательностей, кодирующих антигены. Подобные подходы разработаны и с успехом используются в отечественной эпидемиологической практике для других патогенных микроорганизмов [27], например пневмококков [28].

В этой связи цель данной работы заключалась в создании основанной на ПЦР методике и идентификации с её помощью вариабельных основных поверхностных белков, экспрессируемых B. miyamotoi, циркулирующими на территории России.

Материалы и методы

Последовательности ДНК

Для анализа последовательностей фрагментов генов Vmp c целью выбора олигонуклеотидов для ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РРВ) были использованы нуклеотидные последовательности штаммов Izh-4, Izh-5, Izh-14, Izh 16, Yekat-1 и Yekat-6, депонированные в GenBank (идентификационные номера CP024390-CP024407, CP024205- CP024222, CP024371-CP024389, CP024351- CP024370, CP024333-CP024350 и CP024316- CP024332 соответственно) [16][17], дополненные анализом первичных последовательностей промоторов генов Vmp, выполненным в работах [14][18].

Выделение ДНК, ПЦР и секвенирование

ДНК выделяли из биологических образцов от пациентов с ИКБ-БМ (осадок лейкоцитов в 100 мкл супернатанта, т.е. плазмы крови) набором «РИБОпреп» согласно инструкции к набору реагентов «АмплиСенс® Borrelia miyamotoi-FL» (регистрационное удостоверение РЗН 2018/7316 от 03.07.2018).

Образцы от клещей, собранных в Новосибирской области и на Дальнем Востоке, были предоставлены Е.И. Бондаренко. Присутствие в них ДНК B. miyamotoi (участка гена glpQ) было установлено с помощью диагностического ПЦР-теста «РеалБест ДНК Borrelia miyamotoi» (АО «Вектор-Бест», Новосибирск), регистрационное удостоверение № РЗН 2014/1405 от 26.05.2017 [29]. С.Ю. Ковалевым были предоставлены содержащие ДНК B. miyamotoi образцы от клещей, собранных в Свердловской и Томской областях.

В ПЦР, идентифицирующей Vmp, реакционная смесь объемом 25 мкл содержала праймеры, зонды и dNTP (0,44 мM) — 10 мкл; реактивы «Полимераза TaqF» — 0,5 мкл и «ОТ-ПЦР-смесь-2 FEP/FRT» — 4,5 мкл; выделенную ДНК — 10 мкл. ПЦР-РРВ проводилась в формате «мультипрайм» на приборе «RotorGeneQ» («Qiagen») по следующей программе: 95ºС — 15 мин (1 цикл); 95ºС — 5 с/60ºС — 20 с/72ºС — 10 с (45 циклов с детекцией флуоресцентного сигнала на стадии 60ºС). При анализе результатов амплификации пороговая линия проводилась на уровне 10% от максимального значения флуоресцентного сигнала для каждого из 4 каналов детекции. Все реактивы для ПЦР были произведены в ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии.

Секвенирование продуктов ПЦР проводили с использованием генетического анализатора «3500xL» и соответствующих реагентов фирмы «Applied Biosystems» согласно инструкции изготовителя.

Биологический материал (источники ДНК B. miyamotoi)

Для проверки эффективности разрабатываемой методики использованы биологические образцы от пациентов с установленным диагнозом «ИКБ, безэритемная форма» (172 образца от 172 пациентов) [6–8, 29–31] и суспензии иксодовых клещей (109 образцов) [32][33], собранных на территории ряда регионов России в рамках исследований эпидемиологии и клиники инфекции, вызванной B. miyamotoi (табл. 1). Образцы крови больных собирали, как правило, на пике лихорадки, в период максимальной спирохетемии. Все образцы содержали ДНК B. miyamotoi, что было подтверждено тестированием с использованием набора реагентов «АмплиСенс® Borrelia miyamotoi-FL».

 

Таблица 1. Характеристика биологических образцов, содержащих ДНК B. miyamotoi
Table 1. Characteristics of biological samples containing B. miyamotoi DNA

Источник ДНК
DNA source

Территория
Territory

Годы
Years

Количество образцов Number of samples

Кровь больных ИКБ-БМ

Blood of patients with ixodes tick-borne borreliosis caused by B. miyamotoi

Свердловская область Sverdlovsk region

2015-2018

84

Удмуртская Республика Udmurt Republic

2016

6

Челябинская область Chelyabinsk region

2019

3

Вологодская область Vologda region

2017

1

Новосибирская область Novosibirsk region

2012, 2017, 2018

44

Кемеровская область Kemerovo region

2018

16

Красноярский край Krasnoyarsk Territory

2017-2019

14

Иркутская область Irkutsk region

2014

2

Хабаровский край Khabarovsk Territory

Всего Total

2014

2

172

Суспензии клещей рода Ixodes Suspensions of ticks of Ixodes genus

Новосибирская область Novosibirsk region

2012, 2014, 2017

58

Томская область Tomsk region

2014

17

Республика Алтай Altai Republic

2016

6

Свердловская область Sverdlovsk region

2013, 2014

18

Амурская область Amur region

Всего Total

2016

10

109

От всех пациентов было получено информированное согласие. Исследование образцов проведено в соответствии с разрешением этических комитетов ЦНИИ Эпидемиологии (протокол № 83 от 26.06.2018) и Ижевской государственной медицинской академии (протокол № 17 of 24.12.2012).

Статистические методы

Нижнюю и верхнюю границы доверительного интервала для доли проб определённого типа вычисляли по методу Уилсона [34] при доверительной вероятности («уровне доверия») 0,951. Для оценки значимости различий распределений качественных переменных в группах с помощью программы «SPSS Statistics v.19» («IBM») использовали точный критерий Фишера [35].

Результаты

ПЦР-РРВ методика для антигенной характеристики B. miyamotoi

В геноме B. miyamotoi представлено значительное количество последовательностей, гомологичных генам белков Vlp и Vsp; последовательности находятся на плазмиде экспрессии либо на плазмидах хранения. Для детекции тех последовательностей, которым предположительно соответствуют белковые продукты, место отжига прямого праймера находилось в промоторной области, определённой по последовательности плазмиды lpB [14]. Места отжига обратных праймеров и зондов находились на последовательностях, соответствующим генам белков Vlp и Vsp. Выбранные олигонуклеотиды представлены в табл. 2.

 

Таблица 2. Олигонуклеотиды для амплификации нуклеотидных последовательностей, кодирующих экспрессируемыебелки Vlp и Vsp
Table 2. Oligonucleotides for amplification of nucleotide sequences encoding expressed Vlps and Vsps

Гены Genes

Олигонуклеотид (концентрация, мкМ) Oligonucleotide (concentration, pM)

5’-3’-последовательность*

5’-3’-nucleotide sequences

Vlp, Vsp

VMP-F2 (0,2)

TTATAAAgAATTTgAAAAgTAAgATTCTTgCACTAT

Vlp-S

VLPRI-Ri (0,28)

VLPR-IZ (0,12)

VLPR-IZ-L4 (0,12)**

CCCTTTCCCTAAATTAgCTATCgAAgTT

FAM-CCTTTTgTggATCTTCCCCTCCTCCATTATTACATCC-BHQ.1

FAM-gg+A+TC+T+TCCCC+TCC+TCC+AT-BHQ1

Vsp

I-16-2-Ri (0,28)

I-16-2-IIIZ (0,12)

I-16-2-IIIZ-L2 (0,12)**

AATCACTgTCCCATCAgCCTTTg

R6G-ggTCCCCCACTTCCACAAgATATCATTAC-BHQ.1

R6G-CCCCCAC+TT+CC+AC+AA+gA+TA+TC-BHQ1

Vlp-Y

I-14-2-Ri (0,28)

I-14-2-IIZ3 (0,12)**

CTgACTTTAAAAATCTACTCTgAggACTCTCT

Cy5-CCCgC+T+ACT+A+T+TACAgC+TCACg-BHQ2


Примечание. *FAM, R6G и Cy5 — флуорофоры; BHQ1 и BHQ2 — гасители флуоресценции. **Альтернативные зонды VLPR-IZ-L4 и I-16-2-IIIZ-L2 обладают улучшенными термодинамическими параметрами за счёт использования, как и в структуре зонда I-14-2-IIZ3, конформационно-блокированных нуклеотидов (LNA), перед которыми стоит знак «+». В зондах VLPR-IZ и I-16-2-IIIZ подчеркиванием выделены нуклеотидные последовательности, соответствующие зондам VLPR-IZ-L4 и I-16-2-IIIZ-L2.
Note. Note. *FAM, R6G, and Cy5 — fluorophores; BHQ1 and BHQ2 — fluorescence quenchers. **Alternative probes VLPR-IZ-L4 and I-16-2- IIIZ-L2 have improved thermodynamic parameters, as their structure, like the structure of the I-14-2-IIZ3 probe, incorporates locked nucleic acid (LNA) nucleotides preceded by the + sign. In VLPR-IZ and I-16-2-IIIZ probes, the nucleotide sequences corresponding to probes VLPR-IZ-L4 and I-16-2-IIIZ-L2 are underlined.

Область отжига общего праймера VMP-F2 находится в промоторной области. Место отжига других праймеров и зондов, детектируемых по каналам Green, Yellow и Red, находятся в областях, соответствующих белкам Vlp-δ, Vsp и Vlp-γ. Реакционная смесь содержала положительный внутренний контроль для детекции ДНК B. miyamotoi по каналу Orange — диагностические праймеры и зонд, используемые в наборе реагентов «АмплиСенс® Borrelia miyamotoi-FL».

Для валидации методики были использованы образцы ДНК российских изолятов B. miyamotoi. Во всех случаях были идентифицированы те и только те типы экспрессированных Vmp, которые были присущи этим штаммам по данным полногеномного секвенирования [16][17], а именно Vlp-δ у штаммов Izh-4 и Izh-5, Vlp-γ — у Izh-14, Vsp — у Yekat-1 и Yekat-6, а также одновременно Vlp-δ и Vsp — у Izh-16.

Определение экспрессируемых Vmp B. miyamotoi в образцах биологического материала

Результаты определения типов Vmp B. miyamotoi в биологических образцах, полученных от больных ИКБ-БМ и клещей представлены в табл. 3. Из протестированного 281 образца у 51 (18%) не удалось идентифицировать потенциально экспрессируемый ген Vmp: сигнал детектировался только по каналу Orange. В остальных 230 образцах детектировался положительный сигнал, при этом медианные значения пороговых циклов и их разброс составляли для каналов Green — 31 и 19–42, Yellow — 30 и 21–42, Red — 30 и 21–41. Эти значения соответствовали параметрам амплификации положительного внутреннего контроля — диагностической мишени в геноме B. miyamotoi, детектируемой по каналу Orange: медиана значений пороговых циклов — 28, разброс — 18–37.

 

Таблица 3. Распределение генотипов экспрессируемых Vmp B. miyamotoi, определённых в биологических образцах
Table 3. Distribution of Vmp genotypes expressed by B. miyamotoi Vmp and detected in the biological samples

№

No

Тип гена Vmp в сайте экспрессии The type of Vmp gene at the expression site

Число образцов от больных Number of samples from patients

Доля проб определённого типа,% Percentage of samples of a specific genotype

Нижняя и верхняя границы 95% доверительного интервала* Lower and upper 95% confidence limits*

Число образцов от клещей Number of samples from ticks

Доля проб определённого типа, % Percentage of samples of a specific genotype

Нижняя и верхняя границы 95% доверительного интервала* Lower and upper 95% confidence limits*

1

Только V/p-5 V/p-5 only

63

36,6

 

38

34,9

 

2

Только Vsp Vsp only

42

24,4

 

28

25,7

 

3

Только V/p-Y V/p-Y only

12

7,0

 

5

4,6

 

4

V/p-5 + Vsp

30

17,4

 

2

1,8

 

5

V/p-5 + V/p-Y

1

0,6

 

1

0,9

 

6

Vsp + Vlp-Y

5

2,9

 

3

2,8

 

7

Не определен ** Not identified

19

11,1

7,2-16,6

32

29,4

21,6-38,5

8

Всего образцов Total number of samples

172

100

 

109

100

 

9

Всего положительных образцов (из 172 или 109) Total number of positive samples (from 172 or 109 samples)

153

89,0

83,4-92,8

77

70,6

61,5-78,4

10

Из них выявлен один тип Vmp# Among them — only one Vmp type is identified

117

68,0

60,7-74,5

71

65,1

55,8-73,4

11

Из них выявлены 2 типа Vmp#* Among them — two Vmp types are identified##

36

20,9

15,5-27,6

6

5,5

2,6-11,5

12

V/p-5, всего6

V/p-5, total6

94

49,7

42,7-56,8

41

49,4

38,9-59,9

13

Vsp, всего6

Vsp, total6

77

40,7

34,0-47,9

33

39,8

29,9-50,5

14

V/p-Y, всего6

Vlp-Y, total6

18

9,5

6,1-14,6

9

10,8

5,8-19,3

15

Получено положительных сигналов, всего6 Positive signals received, total6

189

100

 

83

100

 

Примечание. *При доверительной вероятности («уровне доверия») 0,95; **положительный сигнал только по каналу детекции Orange:
детекция присутствия в образце ДНК B. miyamotoi; #положительный сигнал по одному из каналов Green, Yellow или Red и по каналу детекции Orange: детекция присутствия в образце ДНК, кодирующей Vmp; ##положительный сигнал по 2 каналам из 3 (Green, Yellow или Red) и по каналу детекции Orange; &по одиночке или совместно с другим типом Vmp.
Note. *At a confidence level 0.95; **the positive signal only in the orange detection channel: the detection of B. miyamotoi DNA in the sample; #the positive signal in one of the green, yellow or red channel, and in the orange detection channel: The detection of the DNA encoding Vmps in the sample; ##the positive signal in 2 channels out of 3 (green, yellow, or red) and in the orange detection channel; &singly or together with another type of Vmp.

 

Отрицательные результаты (табл. 3, строка 7) значимо реже наблюдаются среди проб от больных, чем среди проб клещей (р = 0,0002, двусторонний точный тест Фишера). При этом доля проб, в которых детектируется Vmp только одного типа (строка 10), практически одинакова среди клинических образцов и клещей (р = 0,7), а вот доля проб, в которых детектируются одновременно два типа Vmp (строка 11), значимо выше среди клинических образцов (р = 0,0003), и именно это приводит к снижению числа отрицательных проб. При более детальном рассмотрении типов гена Vmp и их комбинаций, обнаруживаемых в сайте экспрессии (строки 1–6), обращает на себя внимание комбинация Vlp-δ и Vsp (строка 4), часто выявляемая в образцах от пациентов (р = 0,00003). Остальные различия по встречаемости генотипов Vmp в образцах от больных ИКББМ и клещей не значимы.

Из строк 1–6 табл. 3 очевидно, что встречаемость типов Vmp ранжируется от большей к меньшей: Vlp-δ → Vsp → Vlp-γ. Но нагляднее и правильнее оценить частоту встречаемости положительных сигналов по каждому из каналов детекции (строки 12–15), при этом сигнал, характерный для типа Vmp, учитывается вне зависимости от того, обнаружен он по одиночке или совместно с сигналом от другого типа Vmp. Такой анализ подтверждает ранжирование Vlp-δ → Vsp → Vlp-γ и подчёркивает тот факт, что встречаемость наиболее распространённых типов Vmp одинакова как при острой инфекции ИКБ-БМ, так и в клещах-переносчиках (вероятность верности нулевой гипотезы об отсутствии различий 0,94).

Региональные различия по экспрессии разных типов Vmp, как правило, не достигают статистической значимости, поскольку из многих регионов пока изучены лишь 10–20 образцов (табл. 1). Тем не менее можно отметить, что пробы от больных ИКБ-БМ из Свердловской области реже были отрицательными (у 2,4%), чем из Новосибирской области (у 15,9%), р = 0,008. При этом среди положительных образцов от больных ИКБ-БМ из Свердловской и Новосибирской областей относительные доли Vlp-δ, Vsp и Vlp-γ не различаются (р = 0,71) и близки к значениям, представленным в строках 12–14 табл. 3. С другой стороны, доля отрицательных проб клещей из Свердловской области (39%) и из Новосибирской области (29%) и относительные доли Vlp-δ, Vsp и Vlp-γ в клещах значимо не отличаются (p > 0,45).

Подтверждение верности идентификации экспрессируемых Vmp B. miyamotoi

У части проб нуклеотидные последовательности фрагментов генов Vmp, находящихся в сайте экспрессии, были установлены также путём секвенирования соответствующих фрагментов генома. По данным ПЦР-РРВ, в 19 из секвенированных проб экспрессировался ген Vsp, в 23 — Vlp-δ и в 11 — Vlp-γ.

Во всех случаях секвенированием подтверждены правильность результатов ПЦР-РРВ на образцах ДНК из клещей и крови больных и соответствие мест посадки в нуклеотидных последовательностях-мишенях последовательностям праймеров и зондов, которые первоначально были выбраны исходя из данных полногеномного секвенирования 6 российских изолятов.

Обсуждение

Разработанная методика показала достаточную эффективность при анализе биологических образцов, содержащих ДНК B. miyamotoi, и может далее широко применяться в существующем виде, а также усовершенствоваться. Основных путей развития два: добиться такой же эффективности при анализе других распространённых генотипов B. miyamotoi — «американских» и «европейского», и предусмотреть возможность определения экспрессии более редких генов Vmp — Vlp-α и Vlp-β. Работы в этом направлении ведутся.

Исследование принципиально новых аспектов генетики и эпидемиологии B. miyamotoi поставило и ряд новых вопросов, ответы на которые на данном этапе могут быть только гипотетическими. Во-первых, почему некоторые пробы ДНК B. miyamotoi из крови больных (11%) остаются отрицательными? Предварительные результаты показывают, что включение в систему идентификации дополнительных генов Vlp-α и Vlp-β снижает долю отрицательных результатов лишь на несколько процентов. Поэтому они могут определяться ограничениями чувствительности ПЦР-РРВ либо вследствие низкой бактериальной нагрузки в образцах крови, либо из-за наличия ещё неизвестных мутаций в области посадки праймеров и зондов. Первый вариант представляется более вероятным, поскольку при тщательном проспективном исследовании больных ИКБ-БМ в Екатеринбурге [7][11], своевременном отборе, хранении и транспортировке проб крови и/или ДНК в условиях холодовой цепи долю отрицательных проб удаётся снизить до 3%. Второй вопрос: почему доля отрицательных проб ДНК B. miyamotoi из клещей (29%) значимо выше? Возможно, B. miyamotoi, находясь в клещах, не нуждаются в экспрессии Vmp, по крайней мере, Vmp наиболее распространённых типов: Vlp-δ, Vsp или Vlp-γ. Подобное явление известно для B. burgdorferi sensu lato, которые начинают экспрессировать OspC (outer surface protein C) только в крови человека, где OspC боррелий выполняет защитные функции, в частности препятствует активации системы комплемента на их поверхности [36]. Недавно было показано, что Vlp-δ и Vlp-α B. miyamotoi также ингибируют активацию системы комплемента по альтернативному пути [37].

Наконец, наиболее интригующий вопрос: почему в пробах крови больных ИКБ-БМ (строки 11 и 4 в табл. 3) наша методика ПЦР-РРВ нередко идентифицирует экспрессию двух типов Vmp (в 21%), чаще всего одновременно Vlp-δ и Vsp (в 17%)? Если мы исходим из постулата «единичная боррелия экспрессирует только один ген Vmp, находящийся в сайте экспрессии», то необходимо допустить, что в организме больного человека одновременно присутствует несколько субпопуляций B. miyamotoi. Это не двойная инфекция (микст-инфекция) двумя разными штаммами боррелий, но следствие образования «квазивидов» из одного «предка», находившегося в инфицирующем клеще. Квазивиды могут образовываться в результате фазовых вариаций, т.е. переключения синтеза белков, у части популяции патогена, колонизирующего организм хозяина. Фазовые вариации обычно имеют приспособительное значение. В случае обладающих антигенными свойствами поверхностных белков, в частности Vmp, изменение антигенного профиля предположительно делает боррелии менее чувствительными к бактерицидным антителам, выработавшимся к исходным вариантам антигенов. Такой феномен, называемый «иммунным избеганием» (immune escape), позволяет патогену продлить свое существование в организме хозяина как минимум до выработки антител к новым вариантам антигенов. Генетические механизмы фазовых вариаций детально изучаются на примере белка VlsE B. burgdorferi sensu lato [38]. В опытах на лабораторных животных и/или культуре боррелий показана принципиальная возможность переключения синтеза Vmp для B. hermsii [39, 40] и B. miyamotoi [18]. При остром заболевании ИКББМ более половины пациентов продуцируют антитела к нескольким типам Vmp [7][24], что является косвенным свидетельством наличия феномена «иммунного избегания» in vivo, равно как и обнаруженное в этой работе присутствие нескольких генотипов Vmp, экспрессирующихся в образцах от больных. При лабораторном заражении мелких грызунов российскими штаммами B. miyamotoi проявления «иммунного избегания» были документированы нами прямыми генетическими и серологическими методами [41]. Предположительно, именно из-за «иммунного избегания» у больных ИКБ-БМ в отсутствие адекватной антибиотикотерапии может наблюдаться несколько рецидивов лихорадки [42]. Рецидивирующее течение характерно для клещевых возвратных лихорадок и других возвратных лихорадок, например, для такого жизнеугрожающего заболевания, как боррелиозный вшивый возвратный тиф [2].

Заключение

По мере накопления клинических и полевых биологических образцов, содержащих ДНК возбудителя, в ходе дальнейших эпидемиологических исследований в регионах России и мира с помощью разработанной методики можно будет полнее изучить антигенный спектр штаммов B. miyamotoi, циркулирующих на различных территориях, в сопоставлении с характеристикой более консервативных участков их генома, например, методом мультилокусного секвенирования типирования [27]. Это позволит прояснить этапы эволюции и распространения боррелий B. miyamotoi sensu lato — возбудителей иксодового клещевого боррелиоза, практически не отличающегося по своей эпидемиологической значимости от хорошо известной болезни Лайма.

Второе направление исследования — анализ связи комплекса клинических проявлений и осложнений ИКБ-БМ с типом Vmp, экспрессированного в начале заболевания, и возможного переключения экспрессии («иммунного избегания») в течение инфекционного процесса.

1. Sergeant E.S.G. Epitools Epidemiological Calculators. Canberra: Ausvet; 2018. Available at: http://epitools.ausvet.com.au. В частности, https://epitools.ausvet.com.au/ciproportion

×

Об авторах

К. О. Миронов

Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии Роспотребнадзора

Автор, ответственный за переписку.
Email: mironov@pcr.ru
ORCID iD: 0000-0001-8207-9215

Миронов Константин Олегович — д.м.н., рук. научной группы разработки новых методов выявления генетических полиморфизмов

Москва

Россия

А. В. Титков

Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии Роспотребнадзора

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0001-7548-9267

Титков Антон Владимирович — н.с. лаб. эпидемиологии природно-очаговых инфекций

Москва

Россия

К. В. Кулешов

Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии Роспотребнадзора

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-5238-7900

Кулешов Константин Валерьевич — к.б.н., с.н.с. лаб. молекулярной диагностики и эпидемиологии кишечных инфекций

Москва

Россия

Н. М. Колясникова

Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии Роспотребнадзора; Федеральный научный центр исследований и разработки иммунобиологических препаратов им. М.П. Чумакова РАН»

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-9934-2582

Колясникова Надежда Михайловна — н.с. лаб. Эпидемиологии природно-очаговых инфекций; к.м.н., зав. лаб. клещевого энцефалита и других вирусных энцефалитов

Москва

Россия

Е. И. Бондаренко

АО «Вектор-Бест»

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-4699-9548

Бондаренко Евгений Иванович — к.м.н., н.с. лаб. ПЦР 

Новосибирск

Россия

А. Е. Платонов

Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии Роспотребнадзора

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0001-7450-0081

Платонов Александр Евгеньевич — д.б.н., проф., г.н.с. лаб. эпидемиологии природно-очаговых инфекций

Москва

Россия

Список литературы

  1. Fukunaga M., Takahashi Y., Tsuruta Y., Matsushita O., Ralph D., McClelland M., et al. Genetic and phenotypic analysis of Borrelia miyamotoi sp. nov., isolated from the ixodid tick Ixodes persulcatus, the vector for Lyme disease in Japan. Int. J. Syst. Bacteriol. 1995; 45(4): 804–10. https://doi.org/10.1099/00207713-45-4-804
  2. Платонов А.Е., Малеев В.В., Карань Л.С. Боррелиозные возвратные лихорадки: забытые и новые. Терапевтический архив. 2010; 82(11): 74–80.
  3. Cutler S., Vayssier-Taussat M., Estrada-Peña A., Potkonjak A., Mihalca A.D., Zeller H. A new Borrelia on the block: Borrelia miyamotoi — a human health risk? Euro Surveill. 2019; 24(18): 1800170. https://doi.org/10.2807/1560-7917.ES.2019.24.18.1800170
  4. Карань Л.С., Колясникова Н.М., Махнева Н.А., Топор кова М.Г., Надеждина М.В., Есаулкова А.Ю. и др. Применение ПЦР в режиме реального времени для диагностики различных клещевых инфекций. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2010; 87(3): 72–7.
  5. Platonov A.E., Karan L.S., Kolyasnikova N.M., Makhneva N.A., Toporkova M.G., Maleev V.V., et al. Humans infected with relapsing fever spirochete Borrelia miyamotoi, Russia. Emerg. Infect. Dis. 2011; 17(10): 1816–23. https://doi.org/10.3201/eid1710.101474
  6. Сарксян Д.С. Иксодовый клещевой боррелиоз, вызванный Borrelia miyamotoi, — клинико-­эпидемиологическая характеристика, диагностика, лечение: Автореф. дисс. … д-ра мед. наук. М.; 2016.
  7. Платонов А.Е., Топоркова М.Г., Колясникова Н.М., Стуколова О.А., Долгова А.С., Бродовикова А.В. и др. Клиника иксодового клещевого боррелиоза, вызванного Borrelia miyamotoi, в контексте иммунного ответа на возбудитель. Терапевтический архив. 2017; 89(11): 34–42.
  8. Титков А.В., Платонов А.Е., Стуколова О.А., Миронов К.О., Дмитриева Г.М., Кострыкина Т.В. и др. Эпидемиологические особенности иксодовых клещевых боррелиозов в Красноярском крае в контексте изучения распространенности инфекции, вызываемой Borrelia miyamotoi. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2018; 95(3): 10–8. https://doi.org/10.36233/0372-9311-2018-3-10-18
  9. Kingry L.C., Anacker M., Pritt B., Bjork J., Respicio-Kingry L., Liu G., et al. Surveillance for and discovery of borrelia species in US patients suspected of tick-borne illness. Clin. Infect. Dis. 2018; 66(12): 1864–71. https://doi.org/10.1093/cid/cix1107
  10. Marcos L.A., Smith K., Reardon K., Weinbaum F., Spitzer E.D. Presence of Borrelia miyamotoi infection in a highly endemic area of Lyme disease. Ann. Clin. Microbiol. Antimicrob. 2020; 19(1): 22. https://doi.org/10.1186/s12941-020-00364-0
  11. Платонов A.Е., Коецвелд Ж., Колясникова Н.М., Сарксян Д.С., Топоркова М.Г., Шипулин Г.А. и др. Микробиологическое подтверждение этиологии «иксодового клещевого боррелиоза в безэритемной форме» — инфекции, вызываемой Borrelia miyamotoi. Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2017; 16(1): 29–35.
  12. Koetsveld J., Kolyasnikova N.M., Wagemakers A., Toporkova M.G., Sarksyan D.S., Oei A., et al. Development and optimization of an in vitro cultivation protocol allows for isolation of Borrelia miyamotoi from patients with hard tick-borne relapsing fever. Clin. Microbiol. Infect. 2017; 23(7): 480–4. https://doi.org/10.1016/j.cmi.2017.01.009
  13. Replogle A.J., Sexton C., Young J., Kingry L.C., Schriefer M.E., Dolan M., et al. Isolation of Borrelia miyamotoi and other Borreliae using a modified BSK medium. Sci. Rep. 2021; 11(1): 1926. https://doi.org/10.1038/s41598-021-81252-1
  14. Barbour A.G. Multiple and diverse vsp and vlp sequences in Borrelia miyamotoi, a hard tick-borne zoonotic pathogen. PLoS One. 2016; 11(1): e0146283. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0146283
  15. Kingry L.C., Replogle A., Batra D., Rowe L.A., Sexton C., Dolan M., et al. Toward a complete North American Borrelia miyamotoi genome. Genome Announc. 2017; 5(5). https://doi.org/10.1128/genomeA.01557-16
  16. Kuleshov K.V., Koetsveld J., Goptar I.A., Markelov M.L., Kolyasnikova N.M., Sarksyan D.S., et al. Whole-genome sequencing of six Borrelia miyamotoi clinical strains isolated in Russia. Genome Announc. 2018; 6(1): e01424–17. https://doi.org/10.1128/genomeA.01424-17
  17. Kuleshov K.V., Margos G., Fingerle V., Koetsveld J., Goptar I.A., Markelov M.L., et al. Whole genome sequencing of Borrelia miyamotoi isolate Izh-4: reference for a complex bacterial genome. BMC Genomics. 2020; 21(1): 16. https://doi.org/10.1186/s12864-019-6388-4
  18. Wagemakers A., Koetsveld J., Narasimhan S., Wickel M., Deponte K., Bleijlevens B., et al. Variable major proteins as targets for specific antibodies against Borrelia miyamotoi. J. Immunol. 2016; 196(10): 4185–95. https://doi.org/10.4049/jimmunol.1600014
  19. Koetsveld J., Platonov A.E., Kuleshov K., Wagemakers A., Hoornstra D., Ang W., et al. Borrelia miyamotoi infection leads to cross-reactive antibodies to the C6 peptide in mice and men. Clin. Microbiol. Infect. 2020; 26(4): 513.e1–513.e6. https://doi.org/10.1016/j.cmi.2019.07.026
  20. Harris E.K., Harton M.R., de Mello Marques M.A., Belisle J.T., Molins C.R., Breuner N., et al. Immunoproteomic analysis of Borrelia miyamotoi for the identification of serodiagnostic antigens. Sci. Rep. 2019; 9(1): 16808. https://doi.org/10.1038/s41598-019-53248-5
  21. Tokarz R., Tagliafierro T., Caciula A., Mishra N., Thakkar R., Chauhan L.V., et al. Identification of immunoreactive linear epitopes of Borrelia miyamotoi. Ticks. Tick. Borne. Dis. 2020; 11(1): 101314. https://doi.org/10.1016/j.ttbdis.2019.101314
  22. Jahfari S., Herremans T., Platonov A.E., Kuiper H., Karan L.S., Vasilieva O., et al. High seroprevalence of Borrelia miyamotoi antibodies in forestry workers and individuals suspected of human granulocytic anaplasmosis in the Netherlands. New Microbes New Infect. 2014; 2(5): 144–9. https://doi.org/10.1002/nmi2.59
  23. Jahfari S., Sarksyan D.S., Kolyasnikova N.M., Hovius J.W., Sprong H., Platonov A.E. Evaluation of a serological test for the diagnosis of Borrelia miyamotoi disease in Europe. J. Microbiol. Methods. 2017; 136: 11–6. https://doi.org/10.1016/j.mimet.2017.02.013
  24. Koetsveld J., Kolyasnikova N.M., Wagemakers A., Stukolova O.A., Hoornstra D., Sarksyan D.S., et al. Serodiagnosis of Borrelia miyamotoi disease by measuring antibodies against GlpQ and variable major proteins. Clin. Microbiol. Infect. 2018; 24(12): 1338. https://doi.org/10.1016/j.cmi.2018.03.009
  25. Krause P.J., Carroll M., Fedorova N., Brancato J., Dumouchel C., Akosa F., et al. Human Borrelia miyamotoi infection in California: serodiagnosis is complicated by multiple endemic Borrelia species. PLoS One. 2018; 13(2): e0191725. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0191725
  26. Stukolova O., Koetsveld J., Kolyasnikova N., Sarksyan D., Toporkova M., Karan L., et al. Antibody response in Borrelia miyamotoi infection studied by protein microarray. Int. J. Infect. Dis. 2019; 79: 18.
  27. Миронов К.О. Молекулярно-­биологический мониторинг в эпидемиологическом надзоре за гнойными бактериальными менингитами: Автореф. дисс. … д-ра мед. наук. М.; 2017. Available at: http://www.crie.ru/pdf/disser1%28mironov%29.pdf
  28. Миронов К.О., Корчагин В.И., Михайлова Ю.В., Янушевич Ю.Г., Шеленков А.А., Чагарян А.Н. и др. Характеристика штаммов Streptococcus pneumoniae, выделенных от больных инвазивными пневмококковыми инфекциями, с использованием высокопроизводительного секвенирования. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2020; 97(2): 113–8. https://doi.org/10.36233/0372-9311-2020-97-2-113-118
  29. Бондаренко Е.И., Позднякова Л.Л., Сибирцева C.Г., Тимофеев Д.И., Фоменко Н.В., Иванов М.К. Набор реагентов для выявления Borrelia miyamotoi — возбудителя клещевой возвратной лихорадки методом ПЦР в режиме реального времени. Новости «Вектор­Бест». 2013; 1(67): 2–8.
  30. Краснова Е.И., Савельева М.В., Хохлова Н.И., Проворова В.В., Рар В.А., Мельникова О.В. и др. Особенности клинических проявлений и лабораторной диагностики возвратной клещевой лихорадки, вызванной Borrelia miyamotoi, в Новосибирской области. Эпидемиология и инфекционные болезни. Актуальные вопросы. 2017; (2): 10–5.
  31. Конькова-Рейдман А.Б., Барсукова Д.Н., Бондаренко Е.И., Швалов А.Н., Лучинина С.В. Клинико-эпидемиологические особенности инфекций, экологически связанных с клещами, в Челябинской области. Эпидемиология и инфекционные болезни. 2019; 24(4): 178–87. https://doi.org/10.18821/1560-9529-2019-24-4-178-187
  32. Бондаренко Е.И., Леонова Г.Н., Щучинова Л.Д., Щучинов Л.В., Суховеркова А.В., Иванов Л.И. и др. Распространенность Borrelia miyamotoi – возбудителя клещевой возвратной лихорадки — в семи регионах Сибири и Дальнего Востока. В кн.: Молекулярная диагностика 2017. Сборник трудов IХ Всероссийской научно­-практической конференции с международным участием. М.; 2017: 168–70.
  33. Mukhacheva T.A., Salikhova I.I., Kovalev S.Y. Multilocus spacer analysis revealed highly homogeneous genetic background of Asian type of Borrelia miyamotoi. Infect. Genet. Evol. 2015; 31: 257–62. https://doi.org/10.1016/j.meegid.2015.02.009
  34. Brown L.D., Cai T.T., DasGupta A. Interval estimation for a binomial proportion. Statistical Science. 2001; 16(2): 101–33. https://doi.org/10.1214/ss/1009213286
  35. Платонов А.Е. Статистический анализ в медицине и биологии: задачи, терминология, логика, компьютерные методы. М.: РАМН; 2000.
  36. Tufts D.M., Hart T.M., Chen G.F., Kolokotronis S.O., Diuk-Wasser M.A., Lin Y.P. Outer surface protein polymorphisms linked to host-spirochete association in Lyme borreliae. Mol. Microbiol. 2019; 111(4): 868–82. https://doi.org/10.1111/mmi.14209
  37. Schmidt F.L., Sürth V., Berg T.K., Lin Y.P., Hovius J.W., Kraiczy P. Interaction between Borrelia miyamotoi variable major proteins Vlp15/16 and Vlp18 with plasminogen and complement. Sci. Rep. 2021; 11(1): 4964. https://doi.org/10.1038/s41598-021-84533-x
  38. Chaconas G., Castellanos M., Verhey T.B. Changing of the guard: how the Lyme disease spirochete subverts the host immune response. J. Biol. Chem. 2020; 295(2): 301–13. https://doi.org/10.1074/jbc.REV119.008583
  39. Barbour A.G., Dai Q., Restrepo B.I., Stoenner H.G., Frank S.A. Pathogen escape from host immunity by a genome program for antigenic variation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006; 103(48): 18290–5. https://doi.org/10.1073/pnas.0605302103
  40. Crowder C.D., Ghalyanchi Langeroudi A., Shojaee Estabragh A., Lewis E.R.G., Marcsisin R.A., Barbour A.G. Pathogen and host response dynamics in a mouse model of Borrelia hermsii relapsing fever. Vet. Sci. 2016; 3(3): 19. https://doi.org/10.3390/vetsci3030019
  41. Платонов А.Е., Якименко В.В., Миронов К.О., Стуколова О.А., Титков А.В., Колясникова Н.М. и др. «Иммунное избегание» — один из механизмов патогенеза бактериальных инфекций (на примере иксодового клещевого боррелиоза, вызываемого Borrelia miyamotoi). В кн.: Покровский В.И., ред. Инфекционные болезни в современном мире: эпидемиология, диагностика, лечение и профилактика. Сборник трудов XII Ежегодного Всероссийского интернет-­конгресса по инфекционным болезням с международным участием. М.; 2020.
  42. Сарксян Д.С., Малеев В.В., Платонов А.Е., Платонова О.В., Карань Л.С. Рецидивирующее (возвратное) течение заболевания, вызванного Borrelia miyamotoi. Терапевтический архив. 2015; 87(11): 18–25. https://doi.org/10.17116/terarkh2015871118-25

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать

© Миронов К.О., Титков А.В., Кулешов К.В., Колясникова Н.М., Бондаренко Е.И., Платонов А.Е., 2021

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License.
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: ПИ № ФС77-75442 от 01.04.2019 г.


Данный сайт использует cookie-файлы

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.

О куки-файлах