Адаптация МТТ-теста для определения нейтрализующих антител к вирусу SARS-CoV-2

Полный текст

Введение

Новый коронавирус человека SARS-CoV-2, открытый в декабре 2019 г. в Китае, стал причиной пандемии, унесшей в мире за 2020 г. более 2 млн жизней. Исследования закономерностей иммунного ответа на инфекцию нового коронавируса являются ключевыми для разработки эффективных средств специфической профилактики и иммунотерапии. На сегодняшний день разработано и внедрено в практику лабораторной диагностики множество иммунохимических (преимущественно иммуноферментных) тест-систем для выявления и количественного определения специфических IgG- и IgM-антител к SARS-CoV-2 [1][2]. Однако эти тесты не позволяют оценить функциональную активность специфических антител, например их способность нейтрализовать вирус. Вируснейтрализующие антитела (ВНА) в основном направлены к рецепторсвязывающему домену (RBD) поверхностного гликопротеина S SARS-CoV-2 и при взаимодействии с ним блокируют способность вируса связываться с вирусным рецептором ACE2 на поверхности клетки мишени [3][4] (рис. 1).

Пассивный перенос моноклональных антител, специфичных RBD-домену, чувствительным к инфекции SARS-CoV-2 животным (мыши, хомяки и макаки резусы) показал протективную активность этих препаратов [3][4][5]. Имеется также положительный клинический опыт применения плазмы реконвалесцентов для лечения пациентов с COVID-19 [6][7]. Наличие в препаратах плазмы крови реконвалесцентов и моноклональных антител ВНА является признаком их протективной активности. Основным показателем специфической активности большинства профилактических вакцин против COVID-19 также является наличие ВНА в сыворотке крови вакцинированных лиц [6]. Таким образом, тест на ВНА широко востребован в области биомедицинских исследований.

Традиционные методы оценки активности нейтрализующих SARS-CoV-2 антител основаны на способности ВНА ингибировать бляшкообразование или цитопатогенное действие (ЦПД) вируса на чувствительной культуре клеток [8]. Поскольку работа ведётся с вирулентным штаммом вируса, эти исследования выполняются в лабораториях, отвечающих требованиям безопасности работ с патогенными биологическими объектами II группы патогенности. Также описаны несколько альтернативных подходов к определению ВНА, не требующих работы с вирусом. Это «суррогатные» тест-системы, основанные на твердофазном ИФА с рекомбинантными пептидами RBD и ACE-рецептором [9][10], использовании псевдовирусных частиц на основе рекомбинантных вирусов и различных репортерных систем [11][12]. Некоторые альтернативные подходы к определению ВНА позволяют получать результат значительно быстрее, чем методы, основанные на регистрации вирусного ЦПД. Однако, несмотря на отмеченные ограничения, традиционные методы титрования остаются «золотым стандартом» определения ВНА, поскольку наиболее точно моделируют естественный процесс нейтрализации вируса антителами. Важно отметить, что, вопреки устоявшемуся мнению, нейтрализующие SARS-CoV-2 антитела направлены не только к эпитопам RBD, но и к эпитопам других доменов белка S [5][13][14]. Таким образом, только традиционные культуральные методы оценки ВНА способны выявлять весь спектр циркулирующих в крови нейтрализующих SARS-CoV-2 антител, тогда как «суррогатные» тест-системы, основанные на твердофазном ИФА, выявляют только антитела, направленные к эпитопам RBD.

Целью работы являлся подбор оптимальных условий для определения ВНА к вирусу SARSCoV-2 по ингибированию ЦПД в культуре клеток с возможностью как визуального, так и инструментального учёта результата.

Для достижения поставленной цели были поставлены следующие задачи:

• в чувствительной культуре клеток из клинического образца больного COVID-19 изолировать коронавирус SARS-CoV-2;
• путём пассирования в культуре клеток получить лабораторный штамм SARS-CoV-2, вызывающий полную гибель клеток при малых дозах заражения;
• разработать и апробировать методику оценки титра ВНА к SARS-CoV-2 с детекцией результата в колориметрическом метилтетразолиевом (МТТ) тесте.

Материалы и методы

Клинические образцы. Образцы сыворотки крови, полученные от реконвалесцентов COVID-19 и лиц, не болевших (серонегативных в ИФА), и мазок из ротоглотки пациента с подтверждённым диагнозом COVID-19 предоставлены Клинико-диагностическим центром НИИВС им. И.И. Мечникова. Работы с клиническим материалом проводились в соответствии с международными этическими нормами и с добровольного согласия обследуемых.

Вирус и культура клеток. Использовали лабораторный штамм коронавируса SARS-CoV-2 «Dubrovka» (GenBank: MW514307.1). Культивирование вируса проводили на клетках эпителия почки африканской зелёной мартышки Vero CCL81 (ATСС) (далее — клетки Vero). Клетки культивировали при 37ºС в питательной среде DМЕМ на основе буфера Эрла («ПанЭко», Россия) с добавлением 5% эмбриональной телячьей сыворотки («Gibco»), 300 мкг/мл L-глутамина («ПанЭко»), 40 мкг/мл гентамицина («ПанЭко») в атмосфере с 5% СО₂.

Выявление РНК вируса. Выделение вирусной РНК из клинических и культуральных образцов проводили наборами реагентов «МагноСорб» («ИнтерЛабСервис», Россия) и «РеалБест экстракция 100» («Вектор-Бест», Россия). Вирус SARS-CoV-2 идентифицировали методом ПЦР-РВ с обратной транскрипцией (ОТ) набором реагентов «РеалБест РНК SARS-CoV-2» («Вектор-Бест»). Накопление вируса и репликацию вирусной РНК в культуре клеток контролировали с помощью количественной ОТ-ПЦР-РВ с набором праймеров и зондов к N-гену SARS-CoV-2 [15].

Для постановки реакции ОТ-ПЦР-РВ использовали набор реагентов «2,5х реакционная смесь для ПЦР-РВ с Tag-полимеразой» и обратную транскриптазу MMLV («Синтол»). Реакционная смесь объемом 25 мкл содержала по 10 пмоль каждого праймера и 5 пмоль зонда, Taq ДНК-полимеразу, 30 ед. обратной транскриптазы. Температурно-временной режим: 45°С — 10 мин (1 цикл); 95°С — 5 мин (1 цикл); 95°С — 5 с, 55°С — 45 с (45 циклов). Реакцию проводили в амплификаторе ДТпрайм («ДНК-технология», Россия). Все праймеры и зонды синтезированы в «Синтол».

Секвенирование S-гена SARS-CoV-2. Для секвенирования S-гена SARS-CoV-2 методом ОТПЦР амплифицировали фрагменты S-гена, используя набор праймеров собственного дизайна (табл. 1). Реакцию ОТ проводили в реакционной смеси объемом 100 мкл, содержащей буфер для ОТ («Синтол»), 20 пкмоль праймера CSr0, 24 мкл вирусной РНК, 50 ед. ОТ MMLV («Синтол») в режиме: 10 мин при 42°С, 2 мин при 95°С.

 

Реакцию ПЦР проводили в реакционной смеси объёмом 50 мкл, содержащей «LongAmp™ Taq 2X Master Mix» («NEB»), 5 мкл кДНК, по 10 пкмоль праймеров F и R, в режиме: 94°С — 2 мин (1 цикл), 94°С — 60 с, 55°С — 40 с, 65°С — 100 с (40 циклов), 65°С — 10 мин (1 цикл), хранение при 4°С. Полученные ампликоны идентифицировали по подвижности методом электрофореза в 1% агарозном геле, очищали набором реагентов «Cleanup Mini» («Евроген», Россия).

Концентрацию ПЦР-продуктов оценивали спектрофотометрически и передавали с набором праймеров для секвенирования методом Сэнгера в ЗАО «Синтол». «Сборку» полноразмерного S-гена проводили в программе «VectorNTI 11.0.0» («Invitrоgen Corp.»).

Культивирование коронавируса SARS-CoV-2. За 3 сут до заражения клетки Vero высевали в культуральные флаконы с вентилируемыми крышками («Corning») площадью 75 см² с кратностью пересева 1 : 5. На 3-и сутки, после достижения 100% монослоя, из флакона удаляли культуральную жидкость и добавляли вирусный материал при MOI = 0,01–0,0001 ТЦД₅₀ на клетку. Адсорбцию вируса проводили в СО₂ -инкубаторе в течение 60 мин, затем добавляли поддерживающую среду (DМЕМ, L-глутамин — 300 мкг/мл, гентамицин — 40 мкг/ мл, 1% эмбриональной телячьей сыворотки) и инкубировали при 37°С до проявления ЦПД в атмосфере с 5% СО₂. При появлении ЦПД вируссодержащую культуральную жидкость собирали, осветляли центрифугированием, аликвотировали и хранили при –80°С.

Титрование вируса по конечной точке ЦПД. Титр вируса SARS-CoV-2 определяли по конечной точке проявления ЦПД в культуре клеток Vero. Клетки Vero высевали в 96-луночные планшеты с кратностью пересева 1 : 5. Через 3 сут из лунок планшета удаляли ростовую среду, вносили последовательные 10-кратные разведения вируса в поддерживающей среде и инкубировали в течение 5 сут в СО₂ -инкубаторе при 37°С. Учёт результатов титрования проводили визуально путём микроскопического исследования клеточного монослоя на наличие характерного ЦПД на 5-е сутки после заражения (округление и открепление клеток от монослоя). Титр вируса рассчитывали по методике [16] и выражали в lg ТЦД₅₀/мл.

ИФА на заражённых клетках (In-Cell ELISA). Клетки Vero, выращенные до 100% монослоя в 96-луночном планшете, заражали вирусом при MOI = 0,3. Через 24 ч клетки фиксировали в течение 15 мин раствором 8% параформальдегида, приготовленном на фосфатно-солевом буфере (ФСБ; рН 7,2), промывали дважды ФСБ, планшет хранили при 4°С до постановки ИФА. Перед проведением ИФА в лунки планшета вносили на 30 мин по 150 мкл 0,02 М ФСБ, содержащего 1% Тритона Х-100, затем на 1 ч вносили блокирующий раствор (0,02 М ФСБ, содержащий 0,09% казеината натрия). После удаления блокирующего раствора в лунки планшета вносили по 100 мкл сыворотки крови в разведении 1 : 100 в 0,02 М ФСБ, содержащем 0,2% бычьего сывороточного альбумина, 0,05% Tвин-20 и выдерживали в течение 1 ч при 37°С. После отмывки вносили по 100 мкл конъюгата моноклональных антител мыши к IgG человека с пероксидазой хрена. Повторяли этап инкубации и отмывки, затем вносили по 100 мкл 33 мМ цитратного буферного раствора рН 4,0, содержащего 0,01% перекиси водорода и 0,5 мМ 3,3',5,5' тетраметилбензидина. Через 15 мин реакцию останавливали добавлением 50 мкл 2N серной кислоты, измеряли оптическую плотность (ОП) в двухволновом режиме при основной длине волны 450 нм и длине волны сравнения 680 нм.

Определение антител к вирусу в ИФА. Определение антител класса G к RBD-домену коронавируса SARS-CoV-2 проводили с использованием набора реагентов «SARS-CoV-2-ИФА-IgG» (OOO «МедипалТех»).

За титр антител к SARS-CoV-2 принимали последнее разведение, при котором значение ОП образца было выше, чем порог отсечения в каждом исследовании.

МТТ-тест. Выживаемость клеток Vero, заражённых вирусом, оценивали с помощью витального красителя метилтиазолилтетразолия бромида (МТТ). На 5-е сутки после заражения в лунки с клетками 96-луночного планшета добавляли по 20 мкл раствора МТТ, 5 мг/мл («ПанЭко») и инкубировали при 37°C в атмосфере с 5% CO₂ в течение 2 ч. Далее культуральную жидкость отбирали и добавляли в лунки по 100 мкл диметилсульфоксида («SigmaAldrich») в каждую лунку. С помощью планшетного спектрофотометра определяли ОП каждой лунки при 530 нм с учётом фоновых значений при 620 нм. Выживаемость клеток рассчитывали по формуле:

Выживаемость = (ОП₅₃₀ опытной пробы/ОП₅₃₀ клеточного контроля) × 100%,

где ОП₅₃₀ опытной пробы — среднее значение ОП₅₃₀ в лунках с заражёнными клетками; ОП₅₃₀ клеточного контроля — среднее значение ОП₅₃₀ в лунках с незаражённой клеточной культурой.

Реакция нейтрализации. Определение титра ВНА к SARS-CoV-2 проводили, как описано в работе [17], с модификациями. Образцы сывороток аликвотировали по 100 мкл и хранили при –20°С. Перед постановкой реакции нейтрализации (РН) сыворотку размораживали, прогревали при 56°С в течение 30 мин, готовили последовательные двукратные разведения поддерживающей средой. Разведения сывороток смешивали с равным объёмом вирусного материала SARS-CoV-2 в титре 2 × 10³ ТЦД₅₀/мл и инкубировали при 37°C в атмосфере 5% CO₂ в течение 1 ч. Из 96-луночного планшета с 3-дневным монослоем клеток Vero удаляли среду, в лунки вносили смесь вируса и сыворотки в 4 повторах по 100 мкл (доза вируса — 100 ТЦД₅₀ на лунку) согласно схеме (табл. 2) и инкубировали в течение 5 сут при 37°C в атмосфере с 5% CO₂.

 

Помимо исследуемых образцов, в РН предусматривали следующие контроли: клеточный контроль (КК — незаражённая клеточная культура), вирусный контроль (ВК — клетки, заражённые рабочим разведением вируса), контроль сыворотки (КС — сыворотка в разведении 1 : 20), контроль дозы (КД — пятикратные разведения вируса).

Учёт результата РН проводили визуально путём микроскопического исследования клеток либо спектрофотометрически в колориметрическом тесте МТТ. В целях защиты персонала перед измерением ОП планшет в открытом виде с разных сторон обрабатывали в течение 5 мин ультрафиолетом в боксе микробиологической безопасности. При визуальном учёте нейтрализующим титром сыворотки считали обратное значение её последнего разведения, в котором признаков ЦПД не обнаруживалось в 2 или более лунках. В тесте МТТ учёт нейтрализующего титра проводили спектрофотометрически и считали по последнему разведению, при котором показатель среднего значения ОП_530–620 (далее — ОП₅₃₀) был равен или превышал значения порогового показателя (ПП), определённого по формуле:

ПП = ОП₅₃₀КК — ОП₅₃₀ВК/2 ,

где ОП₅₃₀ КК — среднее значение ОП₅₃₀ в контрольных лунках с незаражённой клеточной культурой; ОП₅₃₀ ВК — среднее значение ОП₅₃₀ в контрольных лунках, содержащих рабочее разведение вируса.

Значения контрольных показателей учитывали следующим образом: КК — клеточный монослой в контрольных лунках должен быть сохранён полностью. ВК — полная дегенерация монослоя клеток в результате ЦПД вируса. Значения ОП₅₃₀ ВК должны быть не выше 0,2, а отношение ОП₅₃₀ КК/ОП₅₃₀ ВК должно быть не менее 8.

Статистическая обработка данных. Статистическую значимость разницы титров антител, учтённых разными методами, оценивали с помощью коэффициента ранговой корреляции Спирмена. Достоверной считали разницу при р < 0,05 и р < 0,001. Качественную оценку показателей проводили по шкале Чеддока, обработку результатов — с помощью программ «Microsoft Excel», «GraphPadPrism».

Требования к безопасности работ. Все работы с вирусом SARS-CoV-2 проводили в условиях, отвечающих требованиям безопасности работ с патогенными биологическими объектами II группы патогенности. Сотрудники, работающие с вирусом, прошли инструктаж по технике безопасности и имеют действующее удостоверение о повышении квалификации по программе «Бактериология. Вирусология. Биологическая безопасность», выданное ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» Роспотребнадзора.

Результаты

Вирус SARS-CoV-2, используемый для постановки РН, получали путём изоляции вируса в культуре клеток Vero из клинического образца. С этой целью использовали мазок из ротоглотки пациентки в возрасте 61 года, в котором методом ОТПЦР-РВ выявлено высокое содержание РНК вируса SARS-CoV-2 (8,82 lg копий/мл). Впоследствии у пациентки развилось заболевание с клиническими признаками COVID-19: кашель, одышка, фебрильная температура, потеря вкуса и обоняния. Компьютерная томография органов грудной полости показала характерное уплотнение лёгочной ткани с общей площадью поражения с обеих сторон 50%. Поставлен диагноз «COVID-19, вирус идентифицирован (U07.1, МКБ 10), внебольничная двусторонняя полисегментарная вирусная пневмония».

Клиническим материалом заразили культуру клеток Vero и инкубировали её в CO₂ -инкубаторе в течение 5 сут до появления признаков ЦПД, проявляющегося в округлении клеток, после чего проводили следующий пассаж. С целью идентификации вируса материал, полученный на разных пассажных уровнях, анализировали на наличие РНК SARS-CoV-2 методом ОТ-ПЦР-РВ с праймерами к N-гену [15]. На 2, 7, 14 и 21-м пассажах в культуральной жидкости выявлена РНК коронавируса SARS-CoV-2 в высокой концентрации (9; 9,7; 9,2 и 9,9 lg копий/мл соответственно). Методом In-Cell ELISA установлено, что нативный вирусный антиген, полученный в заражённых клетках Vero, реагировал с сыворотками реконвалесцентов COVID-19 и не реагировал с сыворотками не болевших людей.

Таксономическая принадлежность изолята к виду Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus и коронавирусу SARS-CoV-2 (клада GH) была установлена путём секвенирования S-гена (GenBank: MW161041.1) и полного генома (GenBank: MW514307.1) с последующим филогенетическим анализом (рис. 2). Выделенному штамму вируса присвоено название «Dubrovka». Последовательность S-гена штамма Dubrovka имела 99,2% сходство со штаммом Wuhan-Hu-1, ставшим причиной эпидемии в г. Ухане (КНР) в декабре 2019 г. Особенностью штамма Dubrovka является делеция в S-гене размером в 27 нт (кодирует в S-белке синтез 9 аминокислот с 68 по 76 а.о. — YMSLGPMVL), по сравнению с S-геном штамма Wuhan-Hu-1, чем и объясняется относительно высокий уровень различий (0,8%) между этими штаммами. Важно отметить, что упомянутая делеция была выявлена в геноме штамма Dubrovka после 1-го пассажа в культуре клеток Vero и сохранялась на 40-м пассажном уровне. В GenBank обнаружено только 2 штамма SARS-CoV-2, выявленных в феврале и марте 2020 г. в Бельгии и Тайване (GenBank: MW368439.1, MT479224.1) и имеющих аналогичную делецию.

При пассировании вируса в культуре клеток Vero титр вируса возрастал (от 4,3 lg ТЦД₅₀/мл на 2-м пассаже до 9,0 lg ТЦД₅₀/мл на 30-м пассаже), а ЦПД становилось всё более выраженным. При визуальном учёте доля погибших клеток на 5-е сутки после заражения повышалась с увеличением пассажного уровня (рис. 3).

В МТТ-тесте показано, что если при заражении вирусом 2-го пассажа выживаемость клеток Vero составляла 92%, то уже к 14-му пассажу достигала минимального уровня (2–4%) (рис. 4).

Таким образом, адаптированный к культуре клеток Vero штамм SARS-CoV-2 при малых дозах заражения вызывал выраженное ЦПД, которое без труда можно детектировать при микроскопическом исследовании монослоя. На основе созданной индикаторной системы была отработана и апробирована РН. Изучена зависимость значения титра ВНА от дозы заражения клеток. С этой целью сыворотка реконвалесцента COVID-19 с высоким титром антител к вирусу SARS-CoV-2 была исследована в РН при 4 дозах заражения: 200, 100, 50 и 25 ТЦД₅₀ на лунку. В результате значения титра ВНА закономерно распределились в обратной зависимости от дозы заражения и составили 160, 320, 640 и 1280 соответственно. В дальнейшей работе мы использовали в РН дозу 100 ТЦД₅₀ на лунку, поскольку в известных нам научных публикациях применялась эта доза [16][18][19].

Далее было проведено исследование в РН сывороток крови, охарактеризованных ранее по содержанию антител к SARS-CoV-2. Было исследовано 46 образцов, содержащих IgG антитела к вирусу в диапазоне разведений (титр) от 1 : 200 до >1 : 3200 (рис. 5, а). Для контроля специфичности также исследовали 20 сывороток пациентов, не содержащих антитела к SARS-CoV-2. Титры ВНА достоверно коррелировали (Спирмен r = 0,714; р < 0,001) с титрами, полученными в ИФА. Все сыворотки, охарактеризованные как отрицательные в ИФА, также показали полное отсутствие вируснейтрализации. Более половины сывороток с титрами в диапазоне от 1 : 200 до 1 : 400 обладали нейтрализующей активностью; только в одной сыворотке с титром 1 : 800 ВНА обнаружены не были, тогда как все сыворотки с титрами от 1 : 1600 до >1 : 3200 обладали нейтрализующей активностью (рис. 5, б).

Далее были отработаны условия спектрофотометрической детекции результатов РН в тесте МТТ. При постановке РН с последующим окрашиванием МТТ визуальное исследование планшет с МТТ показало, что лунки с разведениями сывороток, содержащими защитный титр ВНА, окрашивались в темно-фиолетовый цвет, что полностью согласовывалось с микроскопической оценкой состояния клеток. С увеличением степени разведения сывороток окраска в лунках исчезала, что свидетельствует о гибели клеток при недостаточной для нейтрализации вируса концентрации ВНА. В МТТ-тесте отношение ОП₅₃₀ в лунках с незаражёнными SARS-CoV-2 клетками (КК) к ОП₅₃₀ в заражённых клетках (ВК) в среднем составляло 28 ± 16, что позволяет надёжно оценивать вирус-опосредованное ЦПД. На рис. 6 представлен пример детекции результатов РН в МТТ-тесте, позволивший оценить титр ВНА в сыворотке 1 (1 : 40), сыворотках 2 и 3 (1 : 80).

Всего в РН со спектрофотометрической детекцией в МТТ-тесте было исследовано 30 сывороток. В 16 сыворотках реконвалесцентов COVID-19 были выявлены ВНА к SARS-CoV-2 в разных титрах, тогда как 14 серонегативных в ИФА сывороток не содержали ВНА. Данные, полученные при визуальном микроскопическом учёте и в МТТ-тесте (табл. 3), достоверно коррелировали, коэффициент корреляции по Спирмену (r) составил 0,963 (р < 0,05), что соответствует весьма высокой связи между признаками по шкале Чеддока.

Обсуждение

Определение нейтрализующих антител к SARS-CoV-2 имеет решающее значение для понимания возможного защитного иммунного ответа. В настоящем исследовании разработаны методические подходы к оценке титра ВНА к SARS-CoV-2, в основе которых лежит РН с микроскопической либо спектрофотометрической оценкой выживаемости клеток Vero. Оба этих подхода к учёту результата РН возможны при условии получения выраженного ЦПД вируса в культуре клеток.

Вирус SARS-CoV-2, полученный на ранних пассажных уровнях (от 2 до 7), при заражении культуры клеток приводил к округлению и частичной гибели клеток при высоких дозах заражения, тогда как при низких дозах ЦПД было невыраженным, что затрудняет визуальный учёт ЦПД. Длительная адаптация вируса к культуре клеток Vero позволила получить выраженное ЦПД, что не только снижает субъективизм при микроскопическом учёте результата, но и позволяет успешно учитывать результаты РН в колориметрическом тесте МТТ, визуально оценивая окрашенные лунки планшета, либо спектрофотометрически.

Инструментальный учёт обеспечивает получение результата в числовом формате, что позволяет проводить программную статистическую обработку результата и, что немаловажно, снижает нагрузку на органы зрения работника. Преимуществом МТТ-теста является его доступность в использовании: результаты теста можно учитывать с помощью планшетного спектрофотометра, что не требует дорогостоящего оборудования и реагентов для использования иных методов определения жизнеспособности клеток [20][21][22].

В колориметрическом тесте МТТ живые клетки восстанавливают жёлтый раствор метилтиазолилтетразолия бромида с помощью НАДФ-H-зависимой оксидоредуктазной системы, что приводит к образованию нерастворимых фиолетовых кристаллов формазана, в то время как в мертвых клетках этого не происходит [21][22]. В связи с этим МТТтест имеет преимущество перед методом оценки выживаемости клеток, основанным на окрашивании клеток кристаллическим фиолетовым, который неизбирательно окрашивает как живые, так и мёртвые клетки [23].

В работе продемонстрирована возможность снижения заражающей дозы вируса при постановке РН в 4 раза — со 100 до 25 ТЦД₅₀ на лунку, что повышает чувствительность РН в 4 раза. Следует отметить, что штамм Dubrovka, хорошо адаптированный к культуре клеток, обеспечивает получение выраженного ЦПД и при более низких дозах заражения (менее 25 ТЦД₅₀ на лунку), что повышает ресурс увеличения чувствительности РН.

Малые разведения исследуемых сывороток (1 : 20 и 1 : 40) могут проявлять цитотоксичность, что снижает точность оценки титра ВНА. Важным условием получения надёжного результата РН, особенно при учёте результатов в тесте МТТ, является взятие крови натощак, что минимизирует вероятность токсического эффекта компонентов сывороток на клетки, и обязательное применение контроля сыворотки (внесение в клетки сыворотки в разведении 1 : 20 без вируса).

Заключение

На основе адаптированного к культуре клеток Vero вируса SARS-CoV-2 разработана система оценки титра ВНА, позволяющая учитывать результат как микроскопически, так и с помощью планшетного спектрофотометра в МТТ-тесте. Колориметрический учёт результата позволяет проводить статистическую обработку получаемых данных, что снижает субъективизм при учёте результата и нагрузку на органы зрения, возникающую при микроскопическом учёте. Таким образом, МТТ-тест представляет собой эффективный, производительный подход к автоматизированному учёту результатов РН. Являясь витальным красителем, МТТ выявляет только живые клетки, что повышает надёжность получаемых результатов по сравнению с другими красителями. Разработанные методические подходы имеют большой потенциал практического применения при определении напряжённости противовирусного иммунитета (естественного и поствакцинального), оценке специфической активности плазмы доноров — реконвалесцентов COVID-19, применяемой для экстренной профилактики и лечения заболевания, а также при испытаниях вакцин и диагностических тест-систем в качестве «золотого стандарта» определения ВНА.

Об авторах

А. В. Грачёва

НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0001-8428-4482

Грачева Анастасия Вячеславовна — м.н.с. лаб. молекулярной вирусологии

Москва

Россия

Е. Р. Корчевая

НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-6417-3301

Корчевая Екатерина Романовна — м.н.с. лаб. молекулярной вирусологии

Москва

Россия

А. М. Кудряшова

НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0003-2575-0898

Кудряшова Александра Михайловна — н.с. лаб. медицинской биотехнологии

Москва

Россия

О. В. Борисова

НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-7664-2945

Борисова Ольга Васильевна — к.х.н., зав. лаб. медицинской биотехнологии

Москва

Россия

О. А. Петруша

НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-5022-7962

Петруша Ольга Александровна — м.н.с. лаб. молекулярной вирусологии

Москва

Россия

Д. И. Смирнова

НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0001-7325-0834

Смирнова Дарья Ильинична — м.н.с. лаб. молекулярной вирусологии

Москва

Россия

И. Н. Чернышова

НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0001-5053-2433

Чернышова Ирина Николаевна — с.н.с. лаб. биосинтеза иммуноглобулинов

Москва

Россия

О. А. Свитич

НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0003-1757-8389

Свитич Оксана Анатольевна — д.м.н., проф., член-корр. РАН, зав. лаб. молекулярной иммунологии, директор

Москва

Россия

В. В. Зверев

НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0001-5808-2246

Зверев Виталий Васильевич — д.б.н., проф., академик РАН, зав. лаб. молекулярной биотехнологии

Москва

Россия

Е. Б. Файзулоев

НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова

Автор, ответственный за переписку.
Email: faizuloev@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-7385-5083

Файзулоев Евгений Бахтиерович — к.б.н., зав. лаб. молекуляр-
ной вирусологии

Москва

Россия

Список литературы

Дополнительные файлы