Association of the increased circulating CD62LloCXCR4hi neutrophil count with carotid atherosclerosis

I. I. Dolgushin; Долгушин И. И.; V. V. Genkel; Генкель В. В.; I. L. Baturina; Батурина И. Л.; I. V. Emelyanov; Емельянов И. В.; A. Y. Savochkina; Савочкина А. Ю.; I. I. Shaposhnik; Шапошник И. И.

doi:10.36233/0372-9311-67

Ассоциация увеличения количества циркулирующих CD62L^loCXCR4^hi-нейтрофилов с распространённостью каротидного атеросклероза

Авторы: Долгушин И.И.¹, Генкель В.В.¹, Батурина И.Л.¹, Емельянов И.В.¹, Савочкина А.Ю.¹, Шапошник И.И.¹
Учреждения:
1. Южно-Уральский государственный медицинский университет
Выпуск: Том 98, № 2 (2021)
Страницы: 176-183
Раздел: ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Дата подачи: 22.03.2021
Дата принятия к публикации: 22.03.2021
Дата публикации: 22.03.2021
URL: https://microbiol.crie.ru/jour/article/view/1004
DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-67
ID: 1004

Цитировать

Полный текст

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

Введение. Изучение роли нейтрофилов в инициации и прогрессировании атеросклероза и развитии его осложнений активно ведется лишь на протяжении последних нескольких лет. К настоящему времени имеются данные, свидетельствующие о важной роли оси CXCL12/CXCR4 в поддержании воспаления при различных хронических воспалительных заболеваниях путем задержки нейтрофилов в очагах воспаления.

Цель исследования — установить диагностическую и прогностическую значимость циркулирующих CD62L^loCXCR4^hi-нейтрофилов у пациентов с каротидным атеросклерозом.

Материалы и методы. Обследовали 75 пациентов (52% мужчин и 48% женщин) в возрасте 40–64 лет без установленных атеросклеротических сердечно-сосудистых заболеваний. Всем пациентам проводили дуплексное сканирование артерий каротидного бассейна. Фенотипирование и дифференцировку субпопуляций нейтрофилов осуществляли методом проточной цитометрии с использованием конъюгатов моноклональных антител CD16, CD11b, CD62L, CD182 (CXCR2) и CD184 (CXCR4).

Результаты. Атеросклеротические бляшки в артериях каротидного бассейна были выявлены у 72% пациентов, при этом у большинства пациентов диагностировано стенозирование более одной сонной артерии (СА). Увеличение количества циркулирующих CXCR4^hi-нейтрофилов ассоциировалось с уровнями общего холестерина (r = 0,377; p = 0,001), холестерина липопротеинов низкой плотности (r = 0,293; p = 0,014) и триглицеридов (r = 0,388; p = 0,003). Выявлены прямые корреляционные связи между количеством циркулирующих CXCR4^hi-нейтрофилов и суммарным процентом стенозирования СА (r = 0,300; p = 0,011), а кроме того — с количеством стенозированных СА (r = 0,291; p = 0,034). Отмечено статистически значимое нарастание количества CXCR4^hi-нейтрофилов по мере увеличения количества стенозированных СА (p = 0,025). По данным ROC-анализа, увеличение количества CXCR4^hi-нейтрофилов ≥260 кл/мкл позволяло диагностировать стенозирующее поражение 4 СА с чувствительностью 71,4% и специфичностью 76,6%.

Заключение. У пациентов с каротидным атеросклерозом увеличение циркулирующих CD62L^loCXCR4^hi-нейтрофилов ассоциировалось с увеличением числа стенозированных СА при отсутствии значимых изменений в других оцениваемых субпопуляциях нейтрофильных гранулоцитов. Увеличение количества CD62L^loCXCR4^hi-нейтрофилов позволяло с достаточной чувствительностью и специфичностью диагностировать стенозирующее поражение 4 СА.

Ключевые слова

атеросклероз, нейтрофилы, каротидный атеросклероз, стареющие нейтрофилы

Полный текст

Введение

Изучение роли нейтрофилов в инициации и прогрессировании атеросклероза и развитии его осложнений активно ведется лишь на протяжении последних нескольких лет [1]. Этому во многом способствовали новые открытия в биологии нейтрофилов, которые позволили пересмотреть традиционные представления о длительности их жизни и неоднородности популяционного состава [2]. Открытие новых патофизиологических механизмов, посредством которых нейтрофильные гранулоциты влияют на атерогенез и развитие сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ), привело к рассмотрению их в качестве терапевтической мишени и дало начало целому ряду клинических исследований [3, 4].

Установлено, что на протяжении своей жизни нейтрофилы изменяют фенотип. Это процесс принято обозначать как «старение нейтрофилов» [5]. Центральную роль в данных процессах играет ось C-X-C motif chemokine ligand (CXCL)12/CXCR4 [6]. Также важен тот факт, что старение нейтрофила оказывает существенное влияние на его функциональные особенности: снижается экспрессия CD62L, увеличивается экспрессия CD11b, TLR4, способность к формированию внеклеточных нейтрофильных ловушек и продукции активных форм кислорода [7]. К настоящему времени имеются данные, свидетельствующие о важной роли оси CXCL12/CXCR4 в поддержании воспаления при различных хронических воспалительных заболеваниях путем задержки нейтрофилов в очагах воспаления [8, 9]. Установлено увеличение экспрессии CXCR4 на циркулирующих нейтрофилах при хронических воспалительных заболеваниях, например при системной красной волчанке [10]. В ряде экспериментальных исследований была показана проатерогенная роль CXCL12, являющегося лигандом для CXCR4 [11]. Наблюдается увеличение экспрессии CXCL12 в нестабильных атеросклеротических бляшках (АСБ) [12]. Диагностическая и прогностическая роль циркулирующих CXCR4^hi-нейтрофилов у пациентов с атеросклеротическими ССЗ требует изучения в клинических исследованиях.

Цель исследования: установить диагностическую и прогностическую значимость циркулирующих CD62L^loCXCR4^hi-нейтрофилов у пациентов с каротидным атеросклерозом.

Материалы и методы

В исследование включали 75 пациентов (39 (52%) мужчин и 36 (48%) женщин) в возрасте 40–64 лет без установленных атеросклеротических ССЗ, прошедших дуплексное ультразвуковое сканирование артерий каротидного бассейна по направлению лечащего врача с целью уточнения кардиоваскулярного риска (КВР). Необходимым условием включения пациентов в исследование было подписанное информированное согласие. Протокол исследования был одобрен этическим комитетом ЮУГМУ.

Критериями невключения в исследование и/или исключения из исследования являлись следующие клинические состояния:

установленные ранее атеросклеротические ССЗ (цереброваскулярная болезнь в анамнезе, ишемическая болезнь сердца, заболевание периферических артерий, реваскуляризация коронарных или периферических артерий);
тяжелые нарушения функции печени и почек (снижение скорости клубочковой фильтрации до уровня менее 30 мл/мин/1,73 м²);
злокачественные новообразования;
установленные хронические воспалительные заболевания;
острые воспалительные или инфекционные заболевания в предшествующие 28 дней.

Ультразвуковое исследование

Всем пациентам проводили дуплексное сканирование артерий каротидного бассейна. Осматривали с обеих сторон в продольном и поперечном сечении на всем протяжении следующие сосуды: общие сонные артерии (ОСА) с бифуркацией ОСА, внутренние сонные артерии (ВСА), наружные сонные артерии (НСА) из переднего, латерального и заднего доступов. Исследование проводили в B-режиме, режиме цветового картирования, импульсной допплерографии, энергетической допплерографии на цифровом ультразвуковом многофункциональном диагностическом сканере «Samsung Medison EKO7» с использованием линейного датчика с частотой 10 МГц.

Толщину комплекса интима–медиа (ТКИМ) определяли в автоматическом режиме (функция AutoIMT) с обеих сторон в дистальной трети ОСА на 1 см проксимальнее бифуркации ОСА из переднего доступа. Среднюю ТКИМ ОСА (ТКИМср) определяли по формуле:

ТКИМср =(ТКИМ ОСАслева + ТКИМ ОСАсправа)/2.

АСБ считали фокальное утолщение комплекса интима–медиа более 1,5 мм, либо на 0,5 мм больше окружающей ТКИМ, либо на 50% больше ТКИМ прилежащих участков ОСА [13]. Процент стенозирования измеряли планиметрически в B-режиме по диаметру в поперечном сечении сосуда. Процент стеноза определяли согласно методу ECST (The European Carotid Surgery Trial) [14]. В случае выявления АСБ, стенозирующих просвет сосудов, определяли максимальный процент стеноза у конкретного пациента и суммарный процент стенозирования СА. Определяли количество стенозированных ОСА и ВСА (максимальное количество — 4).

Лабораторное исследование

Определяли следующие лабораторные показатели: общий холестерин (ХС), ХС липопротеинов низкой (ХС ЛПНП) и высокой плотности (ХС ЛПВП), триглицериды, гликированный гемоглобин, креатинин с последующим расчетом скорости клубочковой фильтрации по формуле CKD-EPI, высокочувствительный С-реактивный белок.

Фенотипирование и дифференцировку субпопуляций нейтрофилов осуществляли методом проточной цитометрии на аппарате «Navios 6/2» («Beckman Coulter») с использованием конъюгатов моноклональных антител — CD16–PE– Cy7.0 («Invitrogen»), CD11b–FITC, CD62L–PE («Beckman Coulter»), CD182 (CXCR2)–PE–Cy5.0 («BD Biosciences»), CD184 (CXCR4)–PE–CF594 («BD Biosciences»). Фенотипирование нейтрофилов проводили в цельной крови с детекцией не менее 30 000 событий.

Статистический анализ

Анализ полученных данных проводили с использованием пакета статистического анализа данных «IBM SPSS Statistics v.18». Качественные переменные описывали абсолютными и относительными частотами (процентами). Количественные переменные описывали медианой (Ме) c указанием интерквартильного интервала (Q₂₅–Q₇₅) в случае несоответствия распределения величины нормальному, средним и стандартным отклонением — в случае нормального распределения величины. В целях определения взаимосвязей показателей использовали корреляционный анализ Спирмена. Для оценки значимости различий между двумя группами использовали критерий Манна–Уитни. Различия считали статистически значимыми при критическом уровне значимости 0,05.

Для выявления независимых предикторов зависимой переменной использовали множественный логистический регрессионный анализ, позволяющий выявить зависимость бинарной категориальной переменной от ряда других переменных — как непрерывных, так и категориальных. Для оценки зависимости одной количественной переменной от другой применяли процедуру линейной регрессии. С целью установления пороговых значений
исследуемых показателей проводили ROC-анализ с определением чувствительности и специфичности, а также расчётом площади под характеристической кривой с 95% доверительным интервалом.

Результаты

Клиническая характеристика пациентов представлена в табл. 1.

Таблица 1. Клиническая и лабораторная характеристика пациентов
Table 1. Clinical characteristics of patients

Показатель Parameter	Значение Value
Возраст, лет, Ме (Q₂₅-Q₇₅) Age, years, Ме (Q₂₅-Q₇₅)	50,0 (44,5; 56,0)
Индекс массы тела, кг/м², Ме (Q₂₅-Q₇₅) Body mass index, kg/m², Ме (Q₂₅-Q₇₅)	27,4 (25,0; 31,2)
Ожирение, n (%) Obesity, n (%)	23 (30,6)
Абдоминальное ожирение, n (%) Abdominal obesity, n (%)	45 (60,0)
Курение, n (%) Smoking, n (%)	16 (21,3)
Сахарный диабет 2-го типа, n (%) Type 2 diabetes mellitus, n (%)	5 (6,66)
Артериальная гипертензия, n (%) Hypertension, n (%)	38 (50,6)
Дезагреганты, n (%) Antiplatelets, n (%)	9 (12,0)
ß-Адреноблокаторы, n (%) ß-Blockers, n (%)	19 (25,3)
Ингибиторы ренин-ангиотензин- альдостероновой системы, n (%) Inhibitors of renin-angiotensin system, n (%)	19 (25,3)
Диуретики, n (%) Diuretics, n (%)	8 (10,6)
Статины, n (%) Statins, n (%)	23 (30,6)
Пероральные сахароснижающие препараты, n (%) Oral hypoglycemic agents, n (%)	6 (8,00)
Общий ХС, ммоль/л, Ме (Q₂₅-Q₇₅) Total cholesterol, Ме (Q₂₅-Q₇₅)	5,80 (5,14; 6,50)
ХС ЛПНП, ммоль/л, Ме (Q₂₅-Q₇₅) Low-density lipoproteins cholesterol, Ме (Q₂₅-Q₇₅)	3,46 (2,96; 4,26)
ХС ЛПВП, ммоль/л, Ме (Q₂₅-Q₇₅) High-density lipoproteins cholesterol, Ме (Q₂₅-Q₇₅)	1,40 (1,19; 1,61)
Триглицериды, ммоль/л, Ме (Q₂₅-Q₇₅) Triglycerides, Ме (Q₂₅-Q₇₅)	1,33 (1,00; 1,80)
Высокочувствительный С-реактивный белок, мг/л, Ме (Q₂₅-Q₇₅) High sensitivity C-reactive protein, mg/l, Ме (Q₂₅-Q₇₅)	1,40 (0,85; 3,48)
Гликированный гемоглобин, %, Ме (Q₂₅-Q₇₅) Glycated hemoglobin, %, Ме (Q₂₅-Q₇₅)	5,67 (5,20; 6,05)
Скорость клубочковой фильтрации, мл/мин/1,73 м², Ме (Q₂₅-Q₇₅) Estimated glomerular filtration rate, ml/min/1.73 m², Ме (Q₂₅-Q₇₅)	73,0 (61,8; 96,5)

В соответствии с актуальными европейскими рекомендациями на момент включения в исследование очень высокий КВР был установлен у 13 (17,3%) пациентов, высокий КВР — у 11 (14,6%), умеренный КВР — у 31 (41,3%), низкий — у 20 (26,6%) [15].

АСБ в артериях каротидного бассейна были выявлены у 72% пациентов (табл. 2). При этом у большинства пациентов было диагностировано стенозирование более одной СА.

Таблица 2. Результаты дуплексного ультразвукового сканирования каротидных артерий
Table 2. Results of carotid duplex ultrasound scanning

Показатель Parameter	Значение Value
ТКИМ_ср ОСА, мм, Me (Q₂₅-Q₇₅) Mean carotid intima-media thickness, Me (Q₂₅-Q₇₅)	0,65 (0,56; 0,71)
АСБ в СА, n (%) Carotid plaque, n (%)	54 (72,0)
Максимальный процент стеноза у конкретного пациента, %, Ме (Q₂₅-Q₇₅) Maximal carotid stenosis, Ме (Q₂₅-Q₇₅)	24,0 (0,00; 32,0)
Суммарный процент стенозирования СА, %, Ме (Q₂₅-Q₇₅) Total carotid stenosis, Ме (Q₂₅-Q₇₅)	27,0 (0,00; 73,0)
Стенозы СА >50%, n (%) Carotid stenosis >50%, n (%)	5 (6,66)
Количество стенозированных СА, n (%) Number of carotid arteries with stenosis, n (%)
1	19 (25,3)
2	16 (21,3)
3	12 (16,0)
4	7 (9,33)

По данным корреляционного анализа установлено, что увеличение количества циркулирующих CXCR4^hi-нейтрофилов (табл. 3) ассоциировалось с уровнями общего ХС (r = 0,377; p = 0,001), ХС ЛПНП (r = 0,293; p = 0,014), триглицеридов (r = 0,388; p = 0,003). Также выявлены прямые корреляционные связи между количеством циркулирующих CXCR4^hi-нейтрофилов и суммарным процентом стенозирования СА (r = 0,300; p = 0,011), а кроме того — с количеством стенозированных СА (r = 0,291; p = 0,034).

Таблица 3. Дифференцировка нейтрофилов в исследуемой когорте пациентов
Table 3. Differentiation of neutrophils in the studied cohort of patients

Фенотип нейтрофилов Neutrophil phenotype	Значение, кл/мкл Value, cells/pl
CD16^hiCD11b^hiCD62L^hi(взрослые нейтрофилы) (mature neutrophils)	2666 (2111; 3313)
CD16^hiCD11b^hiCD62U° (активированные нейтрофилы) (activated neutrophils)	27,5 (14,0; 46,2)
CD16^hiCD11b^brCD62L^loCXCR4^hi (стареющие нейтрофилы) (aging neutrophils)	185 (98,5; 269)

Как видно из рис. 1, количество CXCR4^hi-нейтрофилов значимо нарастало по мере увеличения количества стенозированных СА (p = 0,025). Так, у пациентов с поражением 4 СА количество CXCR4^hi-нейтрофилов (341 (229; 420) кл/мкл) было статистически значимо выше, чем у пациентов с поражением 1 СА (182 (85,0; 267) кл/мкл; p = 0,042) и 2 СА (110 (60,5; 232) кл/мкл; p = 0,006). Количество CD16^hiCD11b^brCD62L^loCXCR4^hi-нейтрофилов также было значимо выше у пациентов со стенозами 3 СА в сравнении с пациентами, имеющими стенозы в 2 СА, — 240 (176; 311) кл/мкл против 110 (60,5; 232) кл/мкл (p = 0,020).

Рис. 1. Количество циркулирующих CXCR4^hi нейтрофилов в зависимости от числа поражённых СА.

Fig. 1. The circulating CXCR4^hi neutrophil count in relation to the number of the affected CAs.

С целью определения возможной предиктивной ценности количества циркулирующих CD16^hiCD11b^brCD62L^loCXCR4^hi-нейтрофилов в отношении наличия распространённого атеросклероза артерий каротидного бассейна с формированием стенотического поражения 4 СА был проведен ROC-анализ (рис. 2).

Рис. 2. ROC-кривая для CD16^hiCD11b^brCD62L^loCXCR4^hi-нейтрофилов.

Fig. 2. ROC-curve for CD16^hiCD11b^brCD62L^loCXCR4^hi-neutrophils.

Увеличение количества CXCR4^hi-нейтрофилов ≥260 кл/мкл позволяло диагностировать стенозирующее поражение 4 СА с чувствительностью 71,4% и специфичностью 76,6%. Увеличение порогового значения до 333 кл/мкл позволяло повысить специфичность до 90,6% при снижении чувствительности до 57,1%. По данным логистического регрессионного анализа, при увеличении количества циркулирующих CXCR4^hi-нейтрофилов ≥260 кл/мкл отношение шансов наличия стенозирующего поражения 4 СА составляло 14,1 (95% ДИ 1,6–119; p = 0,015) с поправкой на пол, возраст, наличие сахарного диабета 2-го типа и артериальной гипертензии, курения и уровня ХС ЛПНП.

Обсуждение

Исследования участия клеток врождённого и адаптивного иммунитета в атерогенезе традиционно фокусируются на моноцитах, макрофагах и Т-лимфоцитах. Важнейшая роль нейтрофилов в развитии атеросклероза и его осложнений в настоящее время не вызывает сомнений. Однако имеющиеся данные крайне неоднородны, фрагментарны и требуют дальнейших исследований in vivo [16].

Основными результатами проведённого исследования являются следующие:

1) в исследуемой нами группе пациентов количество «стареющих» нейтрофилов прямо коррелировало с уровнями общего ХС, ХС ЛПНП и триглицеридов;

2) по мере увеличения числа стенозированных СА отмечалось увеличение циркулирующих CD62L^loCXCR4^hi-нейтрофилов при отсутствии значимых изменений в других оцениваемых субпопуляциях нейтрофильных гранулоцитов;

3) увеличение количества CD62L^loCXCR4^hiнейтрофилов позволяло с достаточной чувствительностью и специфичностью диагностировать стенозирующее поражение 4 СА.

CXCL12, также известный как SDF-1 (stromal cell-derived factor-1), — хемокин, играющий ключевую роль в хоуминге нейтрофилов, чьё значение в патогенезе атеросклероза на сегодняшний день точно не установлено [11]. Тем не менее доказано, что в АСБ отмечается увеличение экспрессии СXCL12, а увеличение содержания CXCL12 в сыворотке является фактором прогрессирования атеросклероза и прямо коррелирует с тяжестью коронарного атеросклероза [17, 18]. Известно, что клиренс циркулирующих CD62L^loCXCR4^hi-нейтрофилов происходит преимущественно в ночные часы, когда концентрация СXCL12 в костном мозге достигает пиковых значений [19]. Возможно, что в условиях системного персистирующего низкоинтенсивного воспаления, наблюдающегося при атеросклерозе, и повышения содержания CXCL12 в системной циркуляции и АСБ нарушается миграция стареющих нейтрофилов в костный мозг, увеличиваются продолжительность их жизни и содержание в крови [7]. В свою очередь, субпопуляция CD62L^loCXCR4^hi-нейтрофилов, отличающаяся наиболее активной миграцией в очаги воспаления и способностью к формированию внеклеточных нейтрофильных ловушек и продукции активных форм кислорода, имеет максимальный потенциал для миграции в субэндотелиальное пространство с последующим поддержанием сосудистого воспаления и прогрессирования атеросклероза [8, 19, 20].

По нашему мнению, увеличение количества CD62L^loCXCR4^hi-нейтрофилов по мере увеличения числа СА свидетельствует о большей интенсивности системного воспаления у пациентов, имеющих распространённый поливаскулярный фенотип атеросклероза [21]. Также это может подтверждать активацию одного из воспалительных сигнальных путей — CXCL12/CXCR4. Продемонстрированная в исследовании диагностическая значимость CD62L^loCXCR4^hiнейтрофилов в отношении атеросклеротического поражения СА говорит о возможном практическом применении количественной оценки популяционного состава нейтрофилов в диагностике и прогнозировании атеросклеротических ССЗ.

Представленное исследование имеет ряд ограничений:

небольшое количество включённых в исследование пациентов;
отсутствие определения сывороточной концентрации CXCL12.

Заключение

У пациентов с каротидным атеросклерозом повышение содержания циркулирующих CD62L^loCXCR4^hi-нейтрофилов ассоциировалось с увеличением числа стенозированных СА. Количество CD62L^loCXCR4^hi-нейтрофилов ≥260 кл/мкл позволяло диагностировать стенозирующее поражение 4 СА с чувствительностью 71,4% и специфичностью 76,6%.