EFFECTS OF COPPER AND ZINC CATIONS BOUND BY Y-GLOBULIN FRACTION IN STAPHYLOCOCCUS AUREUS CULTURE

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Сегодня не подлежит сомнению первостепенная роль катионов металлов в поддержании жизнедеятельности бактериальной клетки и реализации ее патогенных свойств в организме хозяина. Выступая структурными, каталитическими или регуляторными компонентами биомакромолекул, металлы вовлечены в обеспечение многих биологических процессов, принципиально важных для функционирования бактериальной клетки и определяющих ее вирулентность [9, 13]. Известно, в то же время, что высокие концентрации катионов токсичны для бактерий. Поэтому бактериальная клетка располагает эволюционно закрепленными механизмами и факторами детоксикации, переводящими металл в состояние и форму, снижающие или исключающие его токсическое воздействие [9, 12 - 14]. К таким факторам и механизмам можно отнести синтез специфических экспортеров металлов Ctr-1, АТФаз типа А и Р [9, 12, 13], экспрессию белков, подобных металлотионеинам [12], активацию импортера Zip8, облегчающего секвестрацию связываемого металла в клетке [9, 12], окисление металлов в периплазме [12]. Работами последнего времени установлено, что в организме человека катионы меди и цинка, критически значимые в биологии ряда патогенных и условно патогенных бактерий [11, 14], могут циркулировать в связанном белками у-глобулиновой фракции состоянии [3, 7, 15]. Хелатирование катионов у-глобулинами и образование белковых металлокомплексов происходят в условиях, приближенных к физиологическим [7, 8], что предполагает возможность прямого контакта патогена с подобными белковыми металлокомплексами в ходе развития инфекционного процесса. Целью работы явилась оценка динамики роста культуры Staphylococcus aureus в присутствии металлокомплексов у-глобулина, образованных с катионами меди и цинка, а также катионов металлов, примененных изолированно, в течение первых 24 час экспозиции. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Для получения белковых металлокомплексов использовали препарат человеческого сывороточного у-глобулина (ICN) в 0,15 М растворе NaCl (pH 7,06 - 7,12) с концентрацией белка по навеске 100 мкг/мл. Освобожденные от крупных ассо-циатов мембранной фильтрацией (0,45 мкм, Millipore) образцы у-глобулина инкубировали в течение 1 час при 37°С с водным сульфатом меди (Merc) или хлоридом цинка; концентрация металла - 0,5 мкг/мл. В качестве контроля использовали образцы у-глобулина, инкубированные в тех же условиях, но без солей указанных металлов. По истечении срока инкубации опытные и контрольные образцы в объеме 10 мл подвергали двукратной молекулярной ультрафильтрации в ячейках Ultracel-30k (Millipore) в режиме 1700 g 5 мин с умеренным охлаждением. По окончании фракционирования супернатанты поднимали из ячеек, восстанавливали в 0,15 М растворе NaCl и как и на всех этапах исследования анализировали спектрофотометрически в ультрафиолете в диапазоне длин волн от 190 до 320 нм с шагом 10 нм в полуавтоматическом режиме с использованием дифференцирующего спектрофотометра PU 8730 UV/VIS (Philips). Содержание свободных (не связавшихся с белком) металлов в фильтрате оценивали с использованием фотометрии реакций комплексообразования: меди - с диэ-тилдитиокарбаматом натрия (pH 9,0 - 9,2), длина волны 440 нм; цинка - с о-фенантролином (нейтральный рН), длина волны 226 нм. Далее производили расчет концентрации металлов, связавшихся с белком. Расчет показателей изменения оптической плотности и молярных отношений в растворе осуществляли на основании концентрации у-глобулина, установленной спектрофотометрически при длине волны 280 нм (коэффициент экстинкции 0,7). Кислотность образцов контролировали с помощью электронного рН метра-иономера Эксперт-001 (Эконикс-Эксперт). Первичная культура S.aureus получена методом посева патологического биоматериала человека на элективные и селективные питательные среды [5]. Для построения кривых роста бактерий из суточной культуры S.aureus, выращенной на чашках Петри с питательным агаром (Himedia), с использованием стандарта мутности и серии последовательных десятикратных разведений в питательном бульоне (Himedia) готовили суспензию, содержавшую ориентировочно 103 КОЕ/мл. В полученную суспензию вносили образцы металлокомплексов у-глобулина с медью или цинком и контрольные белки (конечная концентрация 0,5 мкг/мл), а также солевые растворы меди (водный сульфат, Merc) или цинка (хлорид), содержание металлов в которых соответствовало их количеству, связавшемуся с белком на стадии получения экспериментальных образцов (меди - 1,0 нг/мл, цинка - 2,5 нг/мл в 0,15 М NaCl), или контрольный 0,15 М NaCl. Суспензии бактериальных клеток в объеме 5,0 мл инкубировали при 37°С в течение 24 час. Отбор проб и подсчет числа КОЕ в культуре производили в сроки 1,5; 3,0; 4,5; 6,0 и 24 час инкубации в соответствии с принятым микрометодом определения жизнеспособности бактерий. РЕЗУЛ ЬТАТЫ Как видно на рис., белок, трансформированный связыванием катионов меди, реализует бактериостатическую активность в логарифмической фазе роста культуры S.aureus в сроки от 3,0 до 6,0 час инкубации бактериальных клеток. В сравнении с контрольным 0,15 М раствором NaCl торможение роста культуры составило от 0,11 до 0,41 ед. логарифма КОЕ/мл, или от 2,30х105 до 1,03х107 клеток /мл. Обнаруженная активность, по-видимому, определяется хелатированными белком катионами меди, способными в еще большей степени, чем полученный металло-комплекс, ослаблять пролиферацию бактериальных клеток на те же сроки инкубации S.aureus. В сравнении с 0,15 М раствором NaCl, в присутствии меди, примененной в контрольной дозе 1,0 нг/мл, торможение роста культуры составило от 0,35 до 0,59 ед. логарифма КОЕ/мл, или от 1,35х105 до 1,65х107 клеток/мл. в,О, 1,0 -.-.-. 3,0 4.Ь □.£ Показатели роста культуры S.aureus в присутствии металлокомплексов человеческого сывороточного у-глобулина, образованных с катионами меди, и катионов меди, примененных изолированно. По оси абсцисс: время инкубации, час; по оси ординат: lg (КОЕ/мл); ось абсцисс проведена по концентрации 104 КОЕ/мл. 1 - 0,15 М раствор NaCl; 2 - трансформированный медью у-глобулин (белка 0,5 мкг/мл, связанной меди 1,0 нг/мл); 3 - медь (1,0 нг/мл в 0,15 М растворе NaCl). В исследованиях примененные в дозе 1,0 нг/мл катионы меди проявляли тенденцию к реализации бактериостатической активности даже в отношении бактерий Pseudomonas aeruginosa. В сравнении с бактериями, инкубированными в присутствии 0,15 М раствора NaCl, торможение роста культуры на сроке наблюдения 4,5 час составило 0,14 ед. логарифма КОЕ/мл, или 7,50х105 клеток/мл. Белок, трансформированный связыванием катионов цинка, аналогично метал-локомплексу у-глобулина, образованному с катионами меди, при выходе на логарифмическую фазу роста культуры S.aureus (срок наблюдения 1,5 час) реализовал бактериостатическую активность. В сравнении с действием препарата нативного у-глобулина, торможение роста клеток в культуре в присутствии полученного метал-локомплекса составило 0,24 ед. логарифма КОЕ/мл, или 7,05х105 клеток/мл. Бактериостатическое действие комплекса с цинком, в отличие от трансформированного медью у-глобулина, не связано с прямыми эффектами металла, который мог бы захватываться бактериями в случае его локализации на внешних металлосвязывающих сайтах белковых молекул, поскольку в присутствии катионов цинка, примененных изолированно в контрольной дозе 2,5 нг/мл, рост культуры S.aureus соответствовал нативному белковому контролю. Сказанное подтверждается результатами, полученными по достижении стационарной фазы роста культуры (24 час экспозиции), когда при попарном сравнении эффектов экспериментальных образцов и их контроля разница в действии цинкового металлокомплекса у-глобулина и изолированно катионов цинка оказывалась максимальной. В исследованиях зарегистрировать эффекты белкового металлокомплекса, образованного с катионами цинка, в культуре клеток не удалось. ОБСУЖДЕНИЕ Планируя постановку описанных экспериментов, мы полагали, что хелатирование из периглобулярного пространства катионов металлов будет приводить к изменению (нарастанию) ферментативной активности антител и функционально связанных с ними белков плазмы крови, поскольку эта активность, как показано ранее, реализуется в режиме металлозависимости [1, 2, 4, 6]. Речь могла идти о протеиназной активности (расщепление фибронектина), свойственной гомореактантам [4], и супероксиддисмутазной активности (диспропорцио-нирование свободных радикалов), характеризующейся цинк/медь-зависимостью и определяемой у Р-белков [1], полноразмерных антител [6] и коротких олигопептидов, входящих в структуру аминокислотной последовательности, формирующую «шарнирную» область IgG [2]. Казалось, что встраивание металла в сайты молекул антител, подобное активным центрам металлоферментов, должно усиливать энзиматическую активность последних, а это, в свою очередь, могло бы существенным образом влиять на жизнеспособность бактерий - за счет прямого ферментативного воздействия на поверхностные белковые структуры бактериальной клетки или изменения редокс-потенциала в ее микроокружении. Действительно, металлокомплексы белков у-глобулиновой фракции, образованные с катионами как меди, так и цинка, обладали способностью тормозить размножение бактерий в культуре S.aureus. При этом катионы цинка изолированно такими свойствами не обладали. Следовательно, формирующийся в условиях, приближенных к физиологическим, белковый металлокомплекс с цинком обретает и реализует в культуре бактериальных клеток принципиально новые эффекторные свойства, отсутствующие у его белкового и катионного контроля. В отличие от цинка, свободные катионы меди реализуют в культуре выраженную бактериостатическую активность, которая заметно ослабляется в условиях хелатиро-вания катионов белками у-глобулиновой фракции. При этом, однако способность тормозить рост колоний S.aureus не утрачивается в системе полностью, а реализуется белком, содержащим в составе присоединенные катионы меди. Не исключено, что механизмы детоксикации, выступающие одним из факторов вирулентности бактерий [9, 13], ориентированы на эффлюкс бактериальной клеткой именно свободной меди, которая и активирует эти механизмы [9, 13]. Тогда металл, поступивший в клетку в связанном с белком состоянии, может выводиться бактерией менее эффективно и иметь достаточно времени для реализации своего бактерио-статического действия. Сказанное очевидно демонстрируют результаты опытов с цинком. Цинк, как и медь, в высоких дозах токсичен для бактерий [13]. Его эффлюкс бактериальной клеткой, как и эффлюкс меди, усиливается в условиях внутриклеточного повышения содержания металла [13]. Механизмы детоксикации S.aureus исключают действие свободных катионов цинка и оказываются не эффективными в отношении катионов, поступивших с хелатировавшим их у-глобулином. Следовательно, если в реализацию описанных бактериостатических эффектов металлокомплексов у-глобулина конкретный вклад вносит вызываемое связыванием меди и цинка изменение ферментативной активности антител [2, 6], то обнаруженная разница в свойствах «медного» и «цинкового» белковых комплексов (в сопоставлении с эффектами свободных катионов меди и цинка, соответственно) во многом может определяться активностью бактериальных систем детоксикации, по-разному отвечающих на повышение содержания в клетке свободного и связанного белком металла. В разработке стратегии использования токсических свойств металлов для борьбы с патогенными микроорганизмами следует учитывать однако, что эффективность бактериальных систем детоксикации по тяжелым металлам необычайно высока [9, 12, 13]. В примененных нами экспериментальных условиях обнаружено бактериоста-тическое действие свободных катионов меди в культуре P.aeruginosa. В то же время, известно, что бактерии P.aeruginosa высокорезистентны к меди [14]. Резистентность возникает в динамике длительной экспозиции культуры с самими катионами меди [10], когда бактерии, наряду с резистентностью к меди, обретают устойчивость и к высоким дозам катионов цинка [10].

About the authors

S. B Cheknev

Gamaleya Research Institute of Epidemiology and Microbiology

Moscow, Russia

E. I Vostrova

Gamaleya Research Institute of Epidemiology and Microbiology

Moscow, Russia

L. S Piskovskaya

Gamaleya Research Institute of Epidemiology and Microbiology

Moscow, Russia

A. V Vostrov

Gamaleya Research Institute of Epidemiology and Microbiology

Moscow, Russia

References

Supplementary files