Journal of microbiology, epidemiology and immunobiologyJournal of microbiology, epidemiology and immunobiologyЖурнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии0372-93112686-7613Central Research Institute for Epidemiology51610.36233/0372-9311-2020-97-1-7-14ORIGINAL RESEARCHESОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯResearch ArticleObtaining and Characterization of the Monoclonal Antibodies Against G-Protein of the Respiratory Syncytial VirusПолучение и характеристика моноклональных антител к G-белку респираторно-синцитиального вирусаhttps://orcid.org/0000-0003-1961-9789DemidovaN. A.ДемидоваН. А.
Russian Federation

Natalia А. Demidova —  junior researcher

Moscow 123098

Демидова Наталья Андреевна — младший научный сотрудник

123098, Москва

ailande@yandex.ruhttps://orcid.org/0000-0002-4147-8444KlimovaR. R.КлимоваР. Р.
Russian Federation

Regina R. Klimova — Cand. Sci. (Biol.), senior researcher, Laboratory of cell engineering, D.I. Ivanovsky Institute of Virology

Moscow 123098

Климова Регина Рафаиловна — кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории клеточной инженерии Института вирусологии им. Д.И. Ивановского

123098, Москва

regi.k@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0002-3396-5533KushchA. A.КущА. А.
Russian Federation

Alla A. Kushch — Doct. Sci. (Biol.), Prof., Head, Laboratory of  cell engineering, Department of molecular virology, D.I. Ivanovsky Institute of Virology

Moscow 123098

Кущ Алла Александровна — доктор биологических наук, профессор, руководитель отдела молекулярной вирусологии, заведующий лабораторией клеточной инженерии Института вирусологии им. Д.И. Ивановского

123098, Москва

vitallku@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0002-2801-6843LesnovaE. I.ЛесноваЕ. И.
Russian Federation

Ekaterina I. Lesnova — researcher, Laboratory of cell engineering, D.I. Ivanovsky Institute of Virology

Moscow 123098

Леснова Екатерина Ивановна — научный сотрудник лаборатории клеточной инженерии Института вирусологии им. Д.И. Ивановского

123098, Москва

wolf252006@yandex.ruhttps://orcid.org/0000-0001-5571-5669MasalovaO. V.МасаловаО. В.
Russian Federation

Olga V. Masalova — Doct. Sci. (Biol.), leading researcher, Laboratory of cell engineering, D.I. Ivanovsky Institute of Virology

Moscow 123098

Масалова Ольга Владимировна —  доктор биологических наук, ведущий научный  сотрудник лаборатории клеточной инженерии Института вирусологии им. Д.И. Ивановского

123098, Москва

ol.mas@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0002-2501-2847DorofeevaA. D.ДорофееваА. Д.
Russian Federation

Anastasia D. Dorofeeva — junior researcher

Moscow 105064

Дорофеева Анастасия Дмитриевна — младший научный сотрудник ФГБНУ «НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова»

105064, Москва

d0r0feeva@yandex.ruhttps://orcid.org/0000-0001-9610-0935NikonovaA. A.НиконоваА. А.
Russian Federation

Аlexandra А. Nikonova — Cand. Sci. (Biol.), Head, Laboratory of molecular biotechnology, Department of virology

Moscow 105064

Никонова Александра Александровна — кандидат биологических наук, заведующий лабораторией молекулярной биотехнологии отдела вирусологии

105064, Москва

sana80@list.ruhttps://orcid.org/0000-0001-8466-7993FedorovaN. E.ФедороваН. Е.
Russian Federation

Natalia E. Fedorova —  Cand. Sci. (Biol.), leading reasecher, Laboratory of cell engineering, D.I. Ivanovsky Institute of Virology

Moscow 123098

Федорова Наталья Евгеньевна — кандидат биологических наук, ведущий научный  сотрудник лаборатории клеточной инженерии Института вирусологии им. Д.И. Ивановского

123098, Москва

ninani@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0002-0017-1892ZverevV. V.ЗверевВ. В.
Russian Federation

Vitaly V. Zverev —  Doct. Sci. (Biol.), prof., Academician of RAS, Scientific Director, Mechnikov Research Institute for Vaccines and Sera; Head, Microbiology, virology, immunology department, I.M. Sechenov First Moscow State Medical University oh Ministry of Health of Russian Federation (Sechenov University)

Moscow 105064, 

Moscow 127994

Зверев Виталий Васильевич — доктор биологических наук, профессор, акад. РАН, научный руководитель ФГБНУ «НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова»; заведующий кафедрой микробиологии, вирусологии, иммунологии, ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Минздрава России (Сеченовский Университет)

105064, Москва, 

127994, Москва

vitalyzverev@outlook.comNational Research Centre for Epidemiology and Microbiology named after the honorary academician N.F. GamaleyaФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Минздрава РоссииMechnikov Research Institute for Vaccines and SeraФГБНУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова»I.M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Минздрава России (Сеченовский Университет)020420209717140503202005032020Copyright ©; 2020, Demidova N.A., Klimova R.R., Kushch A.A., Lesnova E.I., Masalova O.V., Dorofeeva A.D., Nikonova A.A., Fedorova N.E., Zverev V.V.Copyright ©; 2020, Демидова Н.А., Климова Р.Р., Кущ А.А., Леснова Е.И., Масалова О.В., Дорофеева А.Д., Никонова А.А., Федорова Н.Е., Зверев В.В.2020Demidova N.A., Klimova R.R., Kushch A.A., Lesnova E.I., Masalova O.V., Dorofeeva A.D., Nikonova A.A., Fedorova N.E., Zverev V.V.Демидова Н.А., Климова Р.Р., Кущ А.А., Леснова Е.И., Масалова О.В., Дорофеева А.Д., Никонова А.А., Федорова Н.Е., Зверев В.В.https://creativecommons.org/licenses/by/4.0https://microbiol.crie.ru/jour/article/view/516

The aim of this study was to obtain hybridomas producing monoclonal antibodies (Mabs) to the G-protein of the respiratory syncytial virus (RSV), and to evaluate their immunological characteristics and virus-neutralizing activity.

Material and methods. Mouse Mabs were obtained using hybridoma technology. The properties of Mabs were studied by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), immunofluorescence staining (IF) of infected cells, as well as by biological neutralization test in vitro (NT). To identify epitopes recognized by the Mabs on G protein ELISA additivity test was used.

Results. Hybridization of splenocytes with Sp2/0 myeloma cells and primary screening showed that 75 hybridomas produce antibodies interacting with purified virus, 17 of them also react with the recombinant G-protein in ELISA. In NT 4, hybridomas suppressed in vitro RSV infection by more than 50%. Cloning of these hybridomas revealed 4 monoclones producing the most active Mabs. Mab 1C11 was IgG2a, 3 others (5D4, 5G11 and 6H4) were IgM. Three IgM Mabs actively reacted with both RSV A2 and Long, and with G-protein; Mab 1C11 was less reactive with all antigens tested. All Mabs suppressed RSV infection, while Mab 5D4 supressed it almost completely (98%). IF analysis showed that all Mabs detected RSV G-protein in the cell cytoplasm, the largest number of infected cells was detected using Mab 5D4 (80%). It was shown that the isolated Mabs were directed to two non-overlapping epitopes on the RSV G-protein.

Conclusion. The isolated Mabs can be used to detect RSV in clinical samples by ELISA and IF. The isolated Mabs can be used for humanized recombinant antibodies construction and for the treatment of RSV infection in future.

Цель работы состояла в получении гибридом, продуцирующих моноклональные антитела (МКА) к G-белку респираторно-синцитиального вируса (РСВ), и в изучении их иммунологических характеристик и вируснейтрализующей активности.

Материал и методы. Мышиные МКА получали с помощью гибридомной технологии. Свойства МКА изучали методами иммуноферментного анализа (ИФА), иммунофлюоресцентного окрашивания (ИФл) зараженных клеток культуры, а также в реакции биологической нейтрализации in vitro (РБН). Взаимное расположение эпитопов, выявляемых МКА на G-белке, определяли с помощью теста аддитивности в ИФА.

Результаты. Гибридизация спленоцитов с клетками миеломы Sp2/0 и первичный скрининг показали, что 75 гибридом продуцируют МКА, взаимодействующие с очищенным вирусом, 17 из которых реагируют также и с рекомбинантным G-белком в ИФА. В РБН 4 гибридомы подавляли РСВ-инфекцию in vitro более чем на 50%. Клонирование этих гибридом позволило выявить 4 моноклона, продуцирующих наиболее активные МКА. МКА 1С11 принадлежали к IgG2a, 3 других (5D4, 5G11 и 6H4) — к IgM. 3 МКА IgM активно реагировали как с РСВ А2 и Long, так и с G-белком, МКА 1С11 были менее активны со всеми антигенами. Все МКА подавляли РСВ-инфекцию, причем МКА 5D4 — практически полностью (98%). ИФл-анализ показал, что все МКА выявляли G-белок РСВ в цитоплазме клеток культуры, наибольшее количество зараженных клеток детектировали с помощью МКА 5D4 (80%). Полученные МКА направлены к двум неперекрывающимся эпитопам на G-белке РСВ.

Заключение. Полученные МКА могут использоваться для обнаружения РСВ в клиническом материале методами ИФА и ИФл. Активность в РБН создает предпосылки для получения на основе МКА гуманизированных рекомбинантных антител и возможность их использования для терапии РСВ-инфекции.

respiratory syncytial virusG-proteinmonoclonal antibodiesELISAimmunofluorescence staining of infected cellsnon-overlapping epitopesреспираторно-синцитиальный вирусG-белокмоноклональные антителаиммуноферментный анализиммунофлюоресцентное окрашивание зараженных клетокнеперекрывающиеся эпитопыThis work was supported by a grant from the Russian Science Foundation 17-15-01525Работа выполнена при поддержке гранта РНФ 17-15-01525Заплатников А.Л., Гирина А.А., Бурцева Е.И., Свинцицкая В.И., Казакова С.А., Леписева И.В. и др. Современные возможности иммунопрофилактики вирусных и бактериальных респираторных инфекций у детей. Русский медицинский журнал. Медицинское обозрение. 2018; 2(1-2): 93-8.Tripp R.A., Power U.F., Openshaw P.J.M., Kauvar L.M. Respiratory syncytial virus: targeting the G protein provides a new approach for an old problem. J. Virol. 2018; 92(3): e01302-17. DOI: http://doi.org/10.1128/JVI.01302-17Pebody R., Moyes J., Hirve S., Campbell H., Jackson S., Moen A., et al. Approaches to use the WHO respiratory syncytial virus surveillance platform to estimate disease burden. Influenza Other Respir. Viruses. Available at: http://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/irv.12667Чубарова А.И., Давыдова И.В., Виноградова И.В., Дегтярева Е.А., Кешишян Е.С., Сафина А.И. и др. Эффективность паливизумаба в снижении частоты госпитализации детей с РСВ инфекцией в группах высокого риска: проспективное наблюдательное многоцентровое исследование. Вестник Российской академии медицинских наук. 2017; 72(4): 282-9. DOI: http://doi.org/10.15690/vramn855O’Brien K.L., Chandran A., Weatherholtz R., Jafri H.S., Griffin M.P., Bellamy T., et al. Efficacy of mot a vizumab for the prevention of respiratory syncytial virus disease in healthy Native American infants: a phase 3 randomised double-blind placebocontrolled trial. Lancet Infect. Dis. 2015; 15(2): 1398-408. DOI: http://doi.org/10.1016/S1473-3099(15)00247-9Bates J.T., Keefer C.J., Slaughter J.C., Kulp D.W., Schief W.R., Crowe J.E. Escape from neutral ization by the respiratory syncytial virus-specific neutralizing monoclonal antibody palivizumab is driven by changes in on-rate of binding to the fusion protein. Virology. 2014; 454-455: 139-44. DOI: http://doi.org/10.1016/j.virol.2014.02.010Jorquera P.A., Tripp R.A. Respiratory syncytial virus: prospects for new and emerging therapeutics. Expert. Rev. Respir. Med. 2017; 11(8): 609-15. DOI: http://doi.org/10.1080/17476348.2017.1338567Boyoglu-Barnum S., Todd S.O., Chirkova T., Barnum T.R., Gaston K.A., Haynes L.M., et al. An anti-G protein monoclonal antibody treats RSV disease more effectively than an anti-F monoclonal antibody in BALB/c mice. Virology. 2015; 483: 117-25. DOI: http://doi.org/10.1016/j.virol.2015.02.035Ueba O. Respiratory syncytial virus. I. Concentration and purification of the infectious virus. Acta. Med. Okayama. 1978; 32(4): 265-72.Xiang K., Cheng Y., Zhou M., Sun L., Ji Y., Wang Y., et al. Production of monoclonal antibody against EP0 protein of pseudorabies virus and determination of its recognized epitope. Monoclon. Antib. Immunodiagn. Immunother. 2014; 33(6): 409-13. DOI: http://doi.org/10.1089/mab.2014.0046Power U.F., Nguyen T.N., Rietveld E., de Swart R.L., Groen J., Osterhaus A.D., et al. Safety and immunogenicity of a novel recombinant subunit respiratory syncytial virus vaccine (BBG2Na) in healthy young adults. J. Infect. Dis. 2001; 184(11): 1456-60. DOI: http://doi.org/10.1086/324426Haynes L.M., Jones L.P., Barskey A., Anderson L.J., Tripp R.A. Enhanced disease and pulmonary eosinophilia associated with formalin-inactivated respiratory syncytial virus vaccination are linked to G glycoprotein CX3C-CX3CR1 interaction and expression of substance P. J. Virol. 2003; 77(18): 9831-44. DOI: http://doi.org/10.1128/JVI.77.18.9831-9844.2003Boyoglu-Barnum S., Todd S.O., Meng J., Barnum T.R., Chirkova T., Haynes L.M., et al. Mutating the CX3C motif in the G protein should make a live respiratory syncytial virus vaccine safer and more effective. J. Virol. 2017; 91(10): e02059-16. DOI: http://doi.org/10.1128/JVI.02059-16Cortjens B., Yasuda E., Yu X., Wagner K., Claassen Y.B., Bakker A.Q., et al. Broadly reactive anti-resp i ra tory syncytial virus G antibodies from exposed individuals effectively inhibit infection of primary airway epithelial cells. J. Virol. 2017; 91(10): e02357-16. DOI: http://doi.org/10.1128/JVI.02357-16Boyoglu-Barnum S., Chirkova T., Anderson L.J. Biology of infection and disease pathogenesis to guide RSV vaccine development. Front. Immunol. 2019; 10: 1675. DOI: http://doi.org/10.3389/fimmu.2019.01675