Journal of microbiology, epidemiology and immunobiologyJournal of microbiology, epidemiology and immunobiologyЖурнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии0372-93112686-7613Central Research Institute for Epidemiology43310.36233/0372-9311-2019-4-64-68ORIGINAL RESEARCHESОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯStudy of the effect of polyelectrolytes with antiviral effect on the activity of influenza virus neuraminidase and the process of oxidative phosphorylation in mitochondrias of cells host organismИзучение влияния полиэлектролитов, обладающих противовирусным действием, на активность нейраминидазы вируса гриппа и процесс окислительного фосфорилирования в митохондриях клеток организма-хозяинаKontarovN. A.КонтаровН. А.
Russian Federation

Moscow

Контаров Николай Александрович, к.б.н.

119991, Москва, ул. Трубецкая, д.8, стр. 2, р.т. (499)246-99-01

PogarskayaI. V.ПогарскаяИ. В.
Russian Federation

Moscow

Москва

YuminovaN. V.ЮминоваН. В.
Russian Federation

Moscow

Москва

Sechenov First Moscow State Medical UniversityПервый московский государственный медицинский университет им. И.М.СеченоваMechnikov Research Institute of Vaccines and SerаНИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова0209201996464680209201902092019Copyright ©; 2019, Kontarov N.A., Pogarskaya I.V., Yuminova N.V.Copyright ©; 2019, Контаров Н.А., Погарская И.В., Юминова Н.В.2019Kontarov N.A., Pogarskaya I.V., Yuminova N.V.Контаров Н.А., Погарская И.В., Юминова Н.В.https://creativecommons.org/licenses/by/4.0https://microbiol.crie.ru/jour/article/view/433

Aim. Study of the inhibitory effect of polyelectrolytes with antiviral effect against influenza neuraminidase. Determination of the type and inhibition constant. The study of the effect of polyelectrolytes (PE) on the process of oxidative phosphorylation in the mitochondria of cells host organism. Materials and methods. Purified influenza virus strains were used: A/VPCH/Weybridge (H7N7), A/Mallard Pennsylvania/10218/84 (H5N2), A/NIBRG-14 (H5N1) with an initial infectious titer of 4,5 lgTCD50/ml. PE solutions of polystyrenesulfonate with a degree of polymerization of 8 (PSS-8) in concentrations of 0,5—4,0 mM and polyallylamine (6 kDa) PAA (6 kDa) in concentrations of 0,5—4,0 μM. To determine the activity of influenza neuraminidase, influenza virus strains were used after the removal of low molecular weight inhibitors of neuraminidase by dialysis against water. The neuraminidase substrate was fetuin at final concentrations of 0,052 to 1,2 μM for PAA (6 kDa) and from 0,052 to 1,2 mM for PSS-8. As quantitative characteristics of respiration and phosphorylation of mitochondria, respiratory coefficients according to Lardi-Velman and Chans-Williams, as well as the ratio of ADP/O were used. Mitochondria were isolated from skeletal muscle. The determination of respiratory coefficients and the ratio of ADP/O) was determined by the polarographic method. Results. A noncompetitive type of inhibition of these PEs was detected in relation to the neuraminidase activity of influenza viruses with inhibition constants KI = 1,6 ± 0.08 μM for PAA (6 kDa) and KI = 1,7 ± 0.085 mM for PSS-8. Respiratory coefficients and the ratio of ADP / 0 were determined in the absence and after addition of PSS-8 and PAA (6 kDa) to mitochondria at concentrations of 20 mM and 10 μM, respectively. A decrease in respiratory coefficients and an ADP/O ratio was observed, indicating an inhibition of the enzymes of the electron-transport chain of mitochondria. At concentrations of less than 20 mM and 10 μM for PSS-8 and PAA (6 kDa), all indicators did not significantly change. Conclusion. The non-competitive mechanism of inhibition of the neuraminidase activity of the influenza PE viruses is explained by the conformational changes in the molecules of the enzyme and/or enzyme-substrate complex and, accordingly, the structural and functional changes in its secondary structure. When going beyond the range of non-toxic concentrations of20 mM for PSS-8 and 10 μM for PAA (6 kDa), inhibition of the mitochondrial respiratory chain enzymes was observed while maintaining the antiviral effect.

Цель. Изучение ингибирующего действия полиэлектролитов (ПЭ), обладающих противовирусным действием, в отношении нейраминидазы вируса гриппа. Определение типа и константы ингибирования. Изучение влияние полиэлектролитов на процесс окислительного фосфорилирования в митохондриях клеток организма-хозяина. Материалы и методы. В работе использовались очищенные штаммы вируса гриппа: А/ВЧП/Вейбридж (Н7N7), А/Маллард Пенсильвания/10218/84 (H5N2), A/NIBRG-14 (H5N1) с исходным инфекционным титром 4,5 lg ТЦД50/мл. Растворы ПЭ полистиролсульфонат со степенью полимеризации 8 (ПСС-8) в концентрациях 0,5 — 4,0 мМ и полиаллиламин (6 кДа) ПАА (6 кДа) в концентрациях 0,5-4,0 мкМ. Для определения активности нейраминидазы вируса гриппа использовали штаммы вируса гриппа после удаления низкомолекулярных ингибиторов нейраминидазы диализом против бидистиллированной воды. Субстратом нейраминидазы являлся фетуин в конечных концентрациях от 0,052 до 1,2 мкМ для ПАА (6 кДа) и от 0,052 до 1,2 мМ для ПСС-8. В качестве количественных характеристик дыхания и фосфорилирования митохондрий использовали дыхательные коэффициенты по Ларди-Вельману (ДКл) и Чансу-Вильямсу (ДКч), а также отношение АДФ/О. Митохондрии выделяли из скелетных мышц. Определение дыхательных коэффициентов и отношения АДФ/O проводили полярографическим методом. Результаты. Выявлен неконкурентный тип ингибирования указанных ПЭ в отношении нейраминидазной активности вирусов гриппа с константами ингибирования К I = 1,6 ± 0,08 мкМ для ПАА (6 кДа) и К I = 1,7 ± 0,085 мМ для ПСС-8. Определены дыхательные коэффициенты и отношение АДФ/O в отсутствии и после добавления к митохондриям ПСС-8 и ПАА (6 кДа) в концентрациях 20 мМ и 10 мкМ, соответственно. Наблюдалось снижение дыхательных коэффициентов и отношения АДФ/O, что указывало на ингибирование ферментов электрон-транспортной цепи митохондрий. При концентрациях менее 20 мМ и 10 мкМ для ПСС-8 и ПАА (6 кДа) все показатели достоверно не менялись. Заключение. Неконкурентный механизм ингибирования нейраминидазной активности вирусов гриппа ПЭ объясняется конформационными изменениями в молекулах фермента и/или фермент-субстратного комплекса и соответственно структурно-функциональными изменениями его вторичной структуры. При выходе за пределы диапазона нетоксических концентраций 20 мкМ для ПСС-8 и 10 мМ для ПАА (6 кДа) наблюдалось ингибирование ферментов дыхательной цепи митохондрий при сохранении противовирусного эффекта.

noncompetitive inhibitionneuraminidaseinfluenza virusinhibition constantsmitochondriarespiratory coefficientsнеконкурентное ингибированиенейраминидазавирус гриппаконстанты ингибированиямитохондриидыхательные коэффициенты1. Артюшенко С.В., Контаров Н.А., Юминова Н.В., Зверев В.В., Контарова Е.О., Балаев Н.В. Влияние полиэлектролитов на инфекционность вируса кори. Журн. микробиол. 2011, 4: 36-40.2. Барковский Е.В., Бокуть С.Б., Бородинский А.Н. Современные проблемы биохимии. Минск, Вышэйша школа, 2013.3. Березин И.В., Клесов А.А. Практический курс химической и ферментативной кинетики. М., МГУ, 1976.4. Контаров Н.А., Ермакова А.А., Гребенкина Н.С., Юминова Н.В., Зверев В.В. Изучение противовирусной активности полиэлектролитов в отношении вируса гриппа. Вопросы вирусологии. 2015, 60 (4): 5-9.5. Мейхи Б.В. Дж. Вирусология: Методы. М., Мир, 1988.6. Chance B., Williams G.R. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. Kinetics of oxygen utilization. J. Biol. Chem. 1955, 1 (217): 383-393.7. Lardy H.A., Wellman H. Oxidative phosphorylations; role of inorganic phosphate and acceptor systems in control of metabolic rates. J. Biol. Chem. 1952, 1(195): 215-224.