Journal of microbiology, epidemiology and immunobiologyJournal of microbiology, epidemiology and immunobiologyЖурнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии0372-93112686-7613Central Research Institute for Epidemiology23210.36233/0372-9311-2017-6-63-72ArticlesСтатьиDESIGN OF HEPATITIS E VIRUS GENOTYPE 1 RECOMBINANT ORF3 PROTEIN BY CODON OPTIMIZATION METHODПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА ORF3 ВИРУСА ГЕПАТИТА Е 1 ГЕНОТИПА С ПРИМЕНЕНИЕМ МЕТОДА ОПТИМИЗАЦИИ КОДОНОВAlatortsevaG. I.АлаторцеваГ. И.
Russian Federation
SidorovA. V.СидоровА. В.
Russian Federation
NesterenkoL. N.НестеренкоЛ. Н.
Russian Federation
LuhverchikL. N.ЛухверчикЛ. Н.
Russian Federation
ZhukinaM. V.ЖукинаМ. В.
Russian Federation
AmiantovaI. I.АмыантоваИ. И.
Russian Federation
MilovanovaA. V.МыловановаА. В.
Russian Federation
VorobevD. S.ВоробьевД. С.
Russian Federation
AmmurYu. I.АммурЮ. И.
Russian Federation
MikhailovM. I.МихайловМ. И.
Russian Federation
KyuregyanK. K.КюрегянК. К.
Russian Federation
KichatovaV. S.КичатоваB. С.
Russian Federation
PotemkinI. A.ПотемкинИ. А.
Russian Federation
IsaevaO. V.ИсаеваО. В.
Russian Federation
MalinnikovaE. Yu.МалинниковаЕ. Ю.
Russian Federation
KarlsenA. A.КарлсенА. А.
Russian Federation
BlinovV. M.БлиновВ. М.
Russian Federation
NurmatovZ. Sh.НурматовЗ. Ш.
Russian Federation
NurmatovA. Z.НурматовА. З.
Russian Federation
KasymovO. T.КасымовО. Т.
Russian Federation
ZhavoronokS. V.ЖаворонокС. В.
Russian Federation
ZverevV. V.ЗверевВ. В.
Russian Federation
Mechnikov Research Institute of Vaccines and SeraНИИ вакцин и сывороток им. И.И.МечниковаMechnikov Research Institute of Vaccines and Sera, Russian Medical Academy of Continuous Professional EducationНИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова, Российская медицинская академия непрерывного профессионального образованияScientific Production Association «Preventive Medicine»НПО «Профилактическая медицина», БишкекBelarusian State Medical UniversityБелорусский государственный медицинский университет28122017946637210042019Copyright ©; 2017, Alatortseva G.I., Sidorov A.V., Nesterenko L.N., Luhverchik L.N., Zhukina M.V., Amiantova I.I., Milovanova A.V., Vorobev D.S., Ammur Y.I., Mikhailov M.I., Kyuregyan K.K., Kichatova V.S., Potemkin I.A., Isaeva O.V., Malinnikova E.Y., Karlsen A.A., Blinov V.M., Nurmatov Z.S., Nurmatov A.Z., Kasymov O.T., Zhavoronok S.V., Zverev V.V.Copyright ©; 2017, Алаторцева Г.И., Сидоров А.В., Нестеренко Л.Н., Лухверчик Л.Н., Жукина М.В., Амыантова И.И., Мылованова А.В., Воробьев Д.С., Аммур Ю.И., Михайлов М.И., Кюрегян К.К., Кичатова B.С., Потемкин И.А., Исаева О.В., Малинникова Е.Ю., Карлсен А.А., Блинов В.М., Нурматов З.Ш., Нурматов А.З., Касымов О.Т., Жаворонок С.В., Зверев В.В.2017Alatortseva G.I., Sidorov A.V., Nesterenko L.N., Luhverchik L.N., Zhukina M.V., Amiantova I.I., Milovanova A.V., Vorobev D.S., Ammur Y.I., Mikhailov M.I., Kyuregyan K.K., Kichatova V.S., Potemkin I.A., Isaeva O.V., Malinnikova E.Y., Karlsen A.A., Blinov V.M., Nurmatov Z.S., Nurmatov A.Z., Kasymov O.T., Zhavoronok S.V., Zverev V.V.Алаторцева Г.И., Сидоров А.В., Нестеренко Л.Н., Лухверчик Л.Н., Жукина М.В., Амыантова И.И., Мылованова А.В., Воробьев Д.С., Аммур Ю.И., Михайлов М.И., Кюрегян К.К., Кичатова B.С., Потемкин И.А., Исаева О.В., Малинникова Е.Ю., Карлсен А.А., Блинов В.М., Нурматов З.Ш., Нурматов А.З., Касымов О.Т., Жаворонок С.В., Зверев В.В.https://creativecommons.org/licenses/by/4.0https://microbiol.crie.ru/jour/article/view/232

Aim. The development of the hepatitis E virus (HEV) genotype 1 full-size ORF3 recombinant polypeptide. Materials and methods. Escherichia coli strains, plasmid vectors, serological and clinical samples, ELISA reagent kits, molecular biological, bioinformatic, biotechnological, biochemical and serological methods. Results. HEV genotype 1 RNA had been isolated from clinical samples collected in Kyrgyzstan. DNA copy of subgenomic virus RNA had been cloned and used for further development of E.coli strains producing full-size recombinant protein ORF3 fused to E.coli beta-galactosidase. Codons optimization method was used in aim to increase expression level of recombinant protein. Recombinant protein ORF3 had been isolated from the inclusion bodies of the E.coli biomass and purified by size exclusion chromatography. Antigenic specificity of recombinant polypeptide had been confirmed by enzyme-linked immunosorbent assay and Western blotting with the specific sera. Conclusion. HEVgenotype 1 ORF3 recombinant antigen had been designed, and it’s applicability in diagnostic tests had been experimentally confirmed.

Цель. Получение рекомбинантного аналога полноразмерного белка ORF3 вируса гепатита Е (ВГЕ) 1 генотипа. Материалы и методы. Штаммы Escherichia coli, плазмидные векторы, серологический и клинический материал, иммуноферментные тест-системы. Молекулярно-биологические, биоинформационные, биотехнологические, биохимические и серологические методы. Результаты. Из препарата РНК ВГЕ 1 генотипа, выделенного от больного из Киргизии, получена рекомбинантная плазмида, содержащая ДНК копию субгеномной вирусной РНК. С использованием данной плазмиды получены штаммы E.coli - продуценты рекомбинантного антигена ORF3 ВГЕ 1 генотипа в виде слитного с Р-галактозидазой E.coli полипептида, содержащего полноразмерную копию белка ORF3. Для повышения уровня экспрессии рекомбинантного белка проведена оптимизация кодонов клонированного фрагмента кДНК. Рекомбинантный белок ORF3 выделен из телец-включений биомассы штамма-продуцента и очищен методом эксклюзионной хроматографии. Антигенная специфичность полученного полипептида подтверждена методами иммуноферментного анализа и вестерн-блоттинга со специфическими сыворотками. Заключение. Разработан рекомбинантный антиген ORF3 ВГЕ 1 генотипа и экспериментально показана возможность его применения в диагностических тестах.

hepatitis E virusgenotype 1 HEVorf3 generecombinant ORF3 antigenELISAWestern blottingвирус гепатита ЕВГЕ 1 генотипаген orf3рекомбинантный антиген ORF3ИФАвестерн-блоттингАлаторцев В.Е., Алаторцева Г.И. Патент РФ, 1992, № 2071501 на изобретение «Вектор pEL5a, предназначенный для экспрессии чужеродной ДНК».Алаторцев В.Е., Алаторцева Г.И. Патент РФ, 1992, № 2043409 на изобретение «Штамм бактерий Escherichia coli, используемый для получения рекомбинантных белков».Алаторцева Г.И. Получение рекомбинантных белков, содержащих антигенные детерминанты вируса гепатита Е, и создание на их основе диагностических тест-систем: Автореф. дисс. канд. биол. наук. М., 2000.Алаторцева Г.И., Сидоров А.В., Нестеренко J1.H. и др. Получение рекомбинантного аналога гликопротеина е вируса Varicella zoster: клонирование, экспрессия и исследование антигенных свойств. Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2016, 15, 1 (86): 77-85.Гловер Д. Новое в клонировании ДНК. Методы. М., 1989.Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М., Мир, 1984.Солонин С.А., Мальцева Н.С., Троценко О.Е. и др. Циркуляция вируса гепатита Е на территории Хабаровского края. Дальневосточный журнал инфекционной патологии. 2010, 16:31-36.Claudia P., Ravasi М.Е. et al. Expression of codon optimized genes in microbial systems: current industrial applications and perspectives. Front. Microbiol. 2014, 5: 2-8.Graff J., Torian U. et al. Abicistronic subgenomic mRNA encodes both the ORF2 and ORF3 proteins of hepatitis E virus. J. Virol. 2006, 80: 5919-5926.Hyams C., Mabayoje D.A., Copping R. et al. Serological cross reactivity to CMV and EBV causes problems in the diagnosis of acute hepatitis E virus infection. J. Med. Virol. 2014, 86 (3): 478-483.Khudyakov Y.E., Khudyakova N.S., Fields H.A. et al. Epitope mapping in proteins of hepatitis E virus. Virology. 1993, 194 (1): 89-96.Khudyakov Y.E., Khudyakova N.S., Jue D.L. et al. Comparative characterization of antigenic epitopes in the immunodominant region of the protein encoded by open reading frame 3 in burmese and mexican strains of hepatitis E virus. J. Gen. Virol. 1994, 75 (3): 641-646.Koonin E.V., Gorbalenya A.E., Purdy M.A. et al. Computer-assisted assignment of functional domains in the nonstructural polyprotein of hepatitis E virus: delineation of an additional group of positive-strand RNA plant and animal viruses. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992, 89 (17): 8259-8263.Kumar S., Tamura K., Nei M. MEG A3: Integrated software for molecular evolutionary genetics analysis and sequence alignment. Briefings Bioinformatics. 2004, 5: 150-163.Kyte J., Doolittle R.F. A simple method for displaying the hydropathic character of a protein. J. Mol. Biol. 1983, 157 (1): 105-132.Ma H., SongX., Li Z. et al. Varying abilities of recombinant polypeptides from different regions of hepatitis E virus ORF2 and ORF3 to detect anti-HEV immunoglobulin M. J. Med. Virol. 2009,81 (6): 1052-1061.Nair V.P., Anang S., Subramani C. et al. Endoplastic reticulum stress induced synthesis of a novel viral factor mediates efficient replication of genotype-1 hepatitis E. PLoS Pathol. 2016, 12 (4): el005521.Obriadina A., Meng J.H., Ulanova T. et al. A new enzyme immunoassay for the detection of antibody to hepatitis E virus. J. Gastroenterol Hepatol. 2002, Suppl 3: 360-364.Resenchuk S.М., Blinov V.M. Alignment service: creation and processing of alignments of sequences of unlimited length. Comput. Appl. Biosci. (CABIOS). 1995, 11 (1): 7-11.Towbin H., Staehlin Т., Gordon Y. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979, 76 (9): 4350-4359.Yarbough P.O., Tam A.W., Fry K.E. et al. Hepatitis E virus: identification of type-common epitopes. J. Virol. 1991, 65 (11): 5790-5797.Yonglin Yang, Shaoli Lin, Yuchen Nan et al. A linear surface epitope in a proline-rich region of ORF3 product of genotype 1 hepatitis E virus. Viruses. 2016, Aug 18;8 (8): pii: E227.Zhou Y., Zhao C., Tian Y. et al. Characteristics and functions of HEVproteins. Adv. Exp. Med. Biol. 2016,948: 17-38.