Aim. In this study we aimed to design the universal genetic construction expressing the light and heavy chains of a chimeric antibody, to develop methodological approaches for the production of chimeric antibodies with defined specificity using the monoclonal antibodies to diphtheria toxin (DT) DT-17 in the CHO cells as an example and to evaluate their immunochemical and effector properties. Materials and methods. Variable region genes of the light and heavy chains of mouse antibodies DT-17 to diphtheria toxin were obtained by PCR method and cloned into pCI-neo plasmid vector. The S V DT -17neo «supervector» containing the genes of a chimeric antibody was constructed by using of genetic engineering techniques. CHO cells were transfected with «supervector» and a highly productive clone secreting chimeric antibodies to DT were collected. Immunochemical methods were used to evaluate antibody activity, and affinity chromatography was used to prepare preparative amounts of the antibodies. Results. U ni versal vectors pLK DT -17 and pHG DT-17 containing light and heavy chain genes of the chimeric antibodies DT -17 to DT were constructed. The variable and constant region genes were flanked by endonuclease restriction sites, which allows to change the specificity of the antibodies. In the future it will make possible to study the modifications of the class and species specificity of the chimeric immunoglobulins. When the CHO cell culture was transfected with the designed vectors, the accumulation of antibodies to DT in the culture medium was detected. The yield of purified DT-17 chimeric antibodies was 4 mg per 1 liter of culture medium. The minimum concentration of chimeric antibodies necessary for DT neutralization in the CHO cells was 30 pg/mL. Conclusion. Universal plasmids encoding the synthesis of light and heavy chains of chimeric DT -17 antibody have been designed. On the basis of these vectors, a «supervector» and a highly productive clone secreting specific antibodies that had neutralizing activity against DT were obtained.
Цель. Получение универсальных генетических конструкций, кодирующих синтез легкой и тяжелой цепей химерного антитела, а также методических подходов для получения химерных антител заданной специфичности на примере моноклональных антител к дифтерийному токсину (ДТ) DT -17 в культуре клеток СНО и оценка их иммунохимических и эффекторных свойств. Материалы и методы. Методом ПЦР были получены гены вариабельных областей легких и тяжелых цепей мышиного антитела к дифтерийному токсину DT -17 и клонированы в плазмидном векторе pCI-neo. Генно-инженерными методами был получен «супервектор» SV DT-17neo, содержащий гены химерного антитела. С использованием культуральных методов «супервектором» была трансфицирована культура клеток СНО и получен высокопродуктивный клон, секретирующий химерные антитела к ДТ. Для оценки активности антител применяли иммунохимические методы, а для получения препаративного количества антител - аффинную хроматографию. Результаты. Были получены универсальные векторы pLK DT-17 и pHG DT-17, содержащие гены легкой и тяжелой цепей химерного антитела к ДТ DT-17, где гены вариабельных и константных областей были фланкированы сайтами рестрикции эндонуклеаз, что позволяет изменять специфичность антител, а в перспективе даст возможность перейти к исследованиям по изменению класса и видовой принадлежности химерного иммуноглобулина. При трансфекции культуры клеток СНО полученными векторами отмечалось накопление антител к ДТ в культуральной жидкости. Выход очищенных химерных антител DT-17 составил 4 мг с 1 л культуральной среды. Минимальная концентрация химерных антител, при которой наблюдалась нейтрализация ДТ в культуре клеток СНО, составила 30 мкг/ мл среды. Заключение. Были сконструированы универсальные плазмиды, кодирующие синтез легкой и тяжелой цепей химерного антитела DT-17. На основе векторов был получен «супервектор» и высокопродуктивный клон, секретирующий специфические антитела, которые обладали нейтрализующей активностью в отношении ДТ.