Introduction. West Nile fever (WNF) is a widespread zoonotic natural focal arbovirus infection. In Russia, intense WNF epidemics are observed in the south and southeast of the European part of the country. Etiotropic treatment and specific immunoprophylaxis for this disease in humans have not been developed. A promising approach to rapid diagnostics of WNV is the detection of pathogen RNA using reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP).
The objective is to develop a method for detecting RNA of West Nile virus (WNV) genotypes 1 and 2 using RT-LAMP with various detection options and to test it on clinical material and samples collected during epizootological monitoring.
Materials and methods. A comparative in silico analysis of WNV genomes was performed using the NCBI GenBank database. The presence of WNV RNA was confirmed by RT-PCR. Detection of RT-LAMP results was performed by gel electrophoresis, in real time, and by endpoint analysis using intercalating dyes. Analytical specificity was tested on clinical and field specimens, as well as cell cultures infected with WNV and heterologous microorganisms. Analytical sensitivity was assessed using a recombinant plasmid containing the target fragment of the WNV cDNA sequence.
Results. The 5'-UTR fragment and the WNV polyprotein gene locus encoding the capsid protein were selected as the target. Eight unique LAMP primers were designed. The reaction mixture composition and RT-LAMP reaction conditions were optimized. The reverse transcription and amplification time was 45 minutes. The analytical sensitivity of the reaction was 5 × 103 GE/mL, and the analytical specificity was 100%, comparable to PCR.
Conclusion. The use of the designed primer set enables rapid, highly sensitive, and specific detection of WNV genotypes 1 and 2 RNA in field and clinical samples using RT-LAMP. The proposed method, along with existing developments for the detection of WNV based on PCR, is promising for molecular genetic diagnostics of WNV.
Введение. Лихорадка Западного Нила (ЛЗН) является одной из широко распространенных зоонозных природно-очаговых арбовирусных инфекций. В России интенсивные проявления эпидемического процесса ЛЗН наблюдаются на юге и юго-востоке европейской части страны. Этиотропное лечение и специфическая иммунопрофилактика заболевания у людей не разработаны. Перспективным направлением экспресс-диагностики ЛЗН является метод обнаружения РНК возбудителя с помощью петлевой изотермической амплификации с обратной транскрипцией (RT-LAMP, reverse transcription loop-mediated isothermal amplification).
Цель — разработка способа обнаружения РНК вируса Западного Нила (ВЗН) генотипов 1 и 2 методом RT-LAMP с различными вариантами детекции и его апробация на клиническом материале и пробах, собранных при эпизоотологическом мониторинге.
Материалы и методы. Сравнительный анализ in silico геномов ВЗН проводили по базе данных GenBank NCBI. Наличие РНК ВЗН подтверждали методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с обратной транскрипцией. Детекцию результатов RT-LAMP осуществляли методом гель-электрофореза в режиме реального времени и по конечной точке с помощью интеркалирующих красителей. Аналитическую специфичность проверяли на клиническом и полевом материале, клеточных культурах, инфицированных ВЗН и гетерологичными микроорганизмами. Аналитическую чувствительность оценивали с помощью рекомбинантной плазмиды, содержащей целевой фрагмент последовательности кДНК ВЗН.
Результаты. В качестве мишени выбран фрагмент 5'-UTR и локус гена полипротеина ВЗН, кодирующий капсидный белок. Сконструированы 8 уникальных LAMP-праймеров. Оптимизирован состав реакционной смеси и условия реакции RT-LAMP. Время обратной транскрипции и амплификации составило 45 мин. Аналитическая чувствительность реакции — 5 × 103 ГЭ/мл, аналитическая специфичность — 100%, что сопоставимо с показателями ПЦР.
Заключение. Применение сконструированного набора праймеров позволяет быстро, с высокой чувствительностью и специфичностью выявлять РНК ВЗН генотипов 1 и 2 в полевом и клиническом материале методом RT-LAMP. Предложенный способ наряду с имеющими разработками по выявлению ВЗН на основе ПЦР перспективен для проведения молекулярно-генетической диагностики ЛЗН.