Journal of microbiology, epidemiology and immunobiologyJournal of microbiology, epidemiology and immunobiologyЖурнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии0372-93112686-7613Central Research Institute for Epidemiology1890310.36233/0372-9311-732ISRLFSORIGINAL RESEARCHESОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯResearch ArticleApplication of the GW module for the immobilization of the red fluorescent protein RFP on peptidoglycan from lactic acid bacteria Lactococcus lactis and Lactobacillus acidophilusИммобилизация красного флюоресцентного белка RFP с помощью модуля GW на пептидогликане молочнокислых бактерий Lactococcus lactis и Lactobacillus acidophilushttps://orcid.org/0000-0002-1069-7572DobryninaOlga Yu.ДобрынинаОльга Юрьевна
Russian Federation

Cand. Sci. (Biol.), senior researcher, Laboratory of biologically active nanostructures

канд. биол. наук, с. н. с. лаб. биологически активных наноструктур

dobryninaolga0201@gmail.comhttps://orcid.org/0009-0009-3378-4204UmyarovAbdul-Khamit M.УмяровАбдулхамит Мустафович
Russian Federation

Cand. Sci. (Biol.), senior researcher, Laboratory of biologically active nanostructures

канд. биол. наук, с. н. с. лаб. биологически активных наноструктур

boltanya2@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0002-1411-651XBolshakovaTatiana N.БольшаковаТатьяна Николаевна
Russian Federation

Dr. Sci. (Biol.), leading researcher, Laboratory of biologically active nanostructures

д-р биол. наук, в. н. с. лаб. биологически активных наноструктур

dobotan@rambler.ruhttps://orcid.org/0000-0001-9273-5423KonstantinovaSvetlana V.КонстантиноваСветлана Васильевна
Russian Federation

scientific researcher, Laboratory of biologically active nanostructures

н. с. лаб. биологически активных наноструктур

sv.konstantinova@yandex.ruhttps://orcid.org/0000-0002-1436-9015GrishinAlexander V.ГришинАлександр Владимирович
Russian Federation

Cand. Sci. (Biol.), researcher, Laboratory of biologically active nanostructures

канд. биол. наук, н. с. лаб. биологически активных наноструктур

grishin-a1@yandex.ruhttps://orcid.org/0000-0002-1806-7575LyaschukAlexander M.ЛящукАлександр Михайлович
Russian Federation

Cand. Sci. (Biol.), senior researcher, Laboratory of biologically active nanostructures

канд. биол. наук, с. н. с. лаб. биологически активных наноструктур

lamy13@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0002-1050-1787LuninVladimir G.ЛунинВладимир Глебович
Russian Federation

Dr. Sci. (Biol.), Professor, leading researcher, Laboratory of biologically active nanostructures

д-р биол. наук, проф., в. н. с. лаб. биологически активных наноструктур

lunin1955@gmail.comThe Honorary Academician N.F. Gamaleya National Research Center for Epidemiology and MicrobiologyФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России130320261031586501082025Copyright ©; 2026, Dobrynina O.Y., Umyarov A.M., Bolshakova T.N., Konstantinova S.V., Grishin A.V., Lyaschuk A.M., Lunin V.G.Copyright ©; 2026, Добрынина О.Ю., Умяров А.М., Большакова Т.Н., Константинова С.В., Гришин А.В., Лящук А.М., Лунин В.Г.2026Dobrynina O.Y., Umyarov A.M., Bolshakova T.N., Konstantinova S.V., Grishin A.V., Lyaschuk A.M., Lunin V.G.Добрынина О.Ю., Умяров А.М., Большакова Т.Н., Константинова С.В., Гришин А.В., Лящук А.М., Лунин В.Г.https://creativecommons.org/licenses/by/4.0https://microbiol.crie.ru/jour/article/view/18903

Introduction. Peptidoglycans from lactic acid bacteria are a safe platform for surface display systems of heterologous proteins for medical purposes. The binding of target proteins to peptidoglycans can occur with the participation of the GW protein module.

Aim: to study the ability of GW module to bind proteins to peptidoglycan derived from lactic acid bacteria.

Materials and methods: The fused protein GW-RFP was obtained with the help of genetically engineering methods. The protein was isolated and purified. Lactic acid bacteria peptidoglycans were isolated and used in the binding reaction with the GW-RFP protein. To monitor the reaction progress, light and fluorescence microscopy and polyacrylamide gel electrophoresis electrophoresis (PAGE) were used.

Results: Methods for isolation and purification of peptidoglycans from Lactococcus lactis and Lactobacillus acidophilus have been developed. The recombinant GW-RFP protein consisting of the red fluorescent protein RFP and the GW module the AltA protein of Staphylococcus aureus has been cloned and expressed in Escherichia coli. It has been shown that the GW-RFP protein binds to the peptidoglycans from L. lactis and L. acidophilus in the amount of 24.9 ± 3.7 μg protein/100 μg (w/w) peptidoglycan from L. lactis and 21.3 ± 3.3 μg protein/100 μg (w/w) peptidoglycan from L. acidophilus. The GW-RFP protein can be removed from the peptidoglycans using a 0.5 M NaCl solution.

Conclusion: The GW module can be used for protein immobilization on the peptidoglycan from both lactococci and lactobacilli.

Введение. Пептидогликаны (ПГ) из молочнокислых бактерий являются безопасной платформой для систем поверхностного дисплея гетерологичных белков медицинского назначения. Прикрепление целевых белков к ПГ может происходить при участии белкового модуля GW.

Цель: изучить возможность использования белковых модулей GW в качестве якоря для связывания различных белков с ПГ из молочнокислых бактерий.

Материалы и методы. С помощью генно-инженерных методик получен продуцент модельного слитого белка GW-RFP. Белок выделен и очищен. ПГ молочнокислых бактерий выделены и использованы в реакции связывания с белком GW-RFP. Для контроля протекания реакции использованы методы световой и флюоресцентной микроскопии, электрофорез в полиакриламидном геле.

Результаты. Отработаны методы выделения и очистки ПГ из Lactococcus lactis и L. acidophilus. Клонирован и экспрессирован в Escherichia coli модельный белок GW-RFP, состоящий из красного флюоресцентного белка RFP и модуля GW, соответствующего первому GW-модулю белка AltA Staphylococcus aureus. Показано, что белок GW-RFP связывается с ПГ L. lactis и L. acidophilus в количестве 24,9 ± 3,7 мкг белка/100 мкг сырого массы ПГ L. lactis и 21,3 ± 3,3 мкг белка/100 мкг сырого веса ПГ L. acidophilus. Белок GW-RFP можно отделить от ПГ с помощью 0,5 М раствора NaCl.

Заключение. Белковый модуль GW может служить якорем для белков, которые нужно иммобилизовать на ПГ, — как лактококков, так и лактобацилл.

Lactic acid bacteriaLactococcus lactisLactobacillus acidophiluspeptidoglycanred fluorescent protein RFPGW moduleмолочнокислые бактерииLactococcus lactisLactobacillus acidophilusпептидогликанкрасный флюоресцентный белок RFPбелковый модуль GWZhou X., Gao M., De X., et al. Bacterium-like particles derived from probiotics: progress, challenges and prospects. Front. Immunol. 2023;14:1263586. DOI: https://doi.org/10.3389/fimmu.2023.1263586Garde S., Chodisetti P.K., Reddy M. Peptidoglycan: structure, synthesis, and regulation. EcoSal Plus. 2021;9(2): eESP-0010-2020. DOI: https://doi.org/10.1128/ecosalplus.esp-0010-2020Galinier A., Delan-Forino C., Foulquier E., et al. Recent advances in peptidoglycan synthesis and regulation in bacteria. Biomolecules. 2023;13(5):720. DOI: https://doi.org/10.3390/biom13050720Turner R.D., Vollmer W., Foster S.J. Different walls for rods and balls: the diversity of peptidoglycan. Mol. Microbiol. 2014;91(5):862–74. DOI: https://doi.org/10.1111/mmi.12513Sun Q., Liu X., Li X. Peptidoglycan-based immunomodulation. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2022;106(3):981–93. DOI: https://doi.org/10.1007/s00253-022-11795-4Bosma T., Kanninga R., Neef J., et al. Novel surface display system for proteins on non-genetically modified gram-positive bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 2006;72(1):880–9. DOI: https://doi.org/10.1128/aem.72.1.880-889.2006Raya-Tonetti F., Müller M., Sacur J., et al. Novel LysM motifs for antigen display on lactobacilli for mucosal immunization. Sci. Rep. 2021;11(1):21691. DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-021-01087-8Zhydzetski A., Głowacka-Grzyb Z., Bukowski M., et al. Agents targeting the bacterial cell wall as tools to combat gram-positive pathogens. Molecules. 2024;29(17):4065. DOI: https://doi.org/10.3390/molecules29174065Oshida T., Sugai M., Komatsuzawa H., et al. A Staphylococcus aureus autolysin that has an N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase domain and an endo-beta-N-acetylglucosaminidase domain: cloning, sequence analysis, and characterization. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1995;92(1):285–9. DOI: https://doi.org/10.1073/pnas.92.1.285Marino M., Banerjee M., Jonquières R., et al. GW domains of the Listeria monocytogenes invasion protein InlB are SH3-like and mediate binding to host ligands. EMBO J. 2002;21(21):5623–34. DOI: https://doi.org/10.1093/emboj/cdf558Zoll S., Schlag M., Shkumatov A.V., et al. Ligand-binding properties and conformational dynamics of autolysin repeat domains in staphylococcal cell wall recognition. J. Bacteriol. 2012;194(15):3789–802. DOI: https://doi.org/10.1128/jb.00331-12Percy M.G., Karinou E., Webb A.J., Gründling A. Identification of a lipoteichoic acid glycosyltransferase enzyme reveals that GW-domain-containing proteins can be retained in the cell wall of Listeria monocytogenes in the absence of lipoteichoic acid or its modifications. J. Bacteriol. 2016;198(15):2029–42. DOI: https://doi.org/10.1128/jb.00116-16Milohanic E., Jonquières R., Cossart P., et al. The autolysin Ami contributes to the adhesion of Listeria monocytogenes to eukaryotic cells via its cell wall anchor. Mol. Microbiol. 2001; 39(5):1212–24. DOI: https://doi.org/10.1111/j.1365-2958.2001.02208.xHell W., Reichl S., Anders A., Gatermann S. The autolytic activity of the recombinant amidase of Staphylococcus saprophyticus is inhibited by its own recombinant GW repeats. FEMS Microbiol. Lett. 2003;227(1):47–51. DOI: https://doi.org/10.1016/s0378-1097(03)00647-5Biswas R., Voggu L., Simon U.K., et al. Activity of the major staphylococcal autolysin Atl. FEMS Microbiol. Lett. 2006;259(2):260–8. DOI: https://doi.org/10.1111/j.1574-6968.2006.00281.xBublitz M., Polle L., Holland C., et al. Structural basis for autoinhibition and activation of Auto, a virulence-associated peptidoglycan hydrolase of Listeria monocytogenes. Mol. Microbiol. 2009;71(6):1509–22. DOI: https://doi.org/10.1111/j.1365-2958.2009.06619.xCarvalho F., Sousa S., Cabanes D. How Listeria monocytogenes organizes its surface for virulence. Front. Cell Infect. Microbiol. 2014;4:48. DOI: https://doi.org/10.3389/fcimb.2014.00048Braun L., Dramsi S., Dehoux P., et al. InlB: an invasion protein of Listeria monocytogenes with a novel type of surface association. Mol. Microbiol. 1997;25(2):285–94. DOI: https://doi.org/10.1046/j.1365-2958.1997.4621825.xStudier F.W. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. Protein Expr. Purif. 2005;41(1):207–34. DOI: https://doi.org/10.1016/j.pep.2005.01.016Bertsche U., Gust A.A. Peptidoglycan isolation and binding studies with LysM-type pattern recognition receptors. Methods Mol. Biol. 2017;1578:1–12. DOI: https://doi.org/10.1007/978-1-4939-6859-6_1Бокша И.С., Лунин В.Г., Данилова М.С. и др. Рекомбинантные эндопептидазы IdeS IdeZ и возможный потенциал их применения. Биохимия. 2023;88(6):900–12. Boksha I.S., Lunin V.G., Danilova T.A., et al. Recombinant endopeptidases IdeS and IdeZ and their potential applications. Biochemistry. 2023;88(6): 900–12. DOI: https://doi.org/10.31857/S0320972523060027 EDN: https://elibrary.ru/edqmnbGadella T.W.J. Jr., van Weeren L., Stouthamer J., et al. mScarlet3: a brilliant and fast-maturing red fluorescent protein. Nat. Methods. 2023;20(4):541–5. DOI: https://doi.org/10.1038/s41592-023-01809-y