Introduction. Complement is a key humoral participant of immunity involved in defensive and pathological processes. Human lysozyme (hLZ), hen egg white lysozyme (HEWL) and lactoferrin (LF) are classical constituents of innate immunity. Complement and proteins of innate immunity are often co-localized but their interaction is poorly understood.
The aim of the work was to characterize functional interaction of LF and hLZ/HEWL with complement.
Materials and methods. Human blood serum was used as a source of complement. The complement classical and alternative pathway models contained antibody-sensitized sheep erythrocytes and rabbit erythrocytes respectively. The level of complement activation was estimated as serum hemolytic activity and anaphylatoxins production measured by ELISA. The bactericidal effect was estimated in colony-count assay. Permeabilization of outer and inner membranes of Escherichia coli ML-35p was evaluated with the use of chromogenic substrates of periplasmic and cytoplasmic enzymes. Enzymatic activity of lysozymes was measured in turbidimetric assay.
Results. We confirmed the data that LF selectively inhibits the classical pathway (IC50 ~ 160 μg/mL; ~ 2 μM). We demonstrated for the first time that hLZ at high concentrations (40—160 μg/mL) moderately enhances the activity of the both complement pathways (C3 and C5 conversion as well as lytic activity) while HEWL at concentrations up to 160 μg/mL does not influence on complement activation. LF and hLZ modulated the classical pathway in an independent manner. LF did not prevent E. coli killing by serum but instead slightly increased bacterial viability in diluted serum. Lysozymes cooperated with complement in bacterial killing but LF partially prevented this in 5% serum. hLZ and HEWL accelerated bacterial inner membrane disruption regardless the presence of LF. The two enzymes accelerated the bactericidal effect of 50% serum, and hLZ did it slightly better than HEWL.
Conclusion. LF and hLZ produce opposing and independent effects on complement. We refine the idea of the interaction between complement and lysozyme and propose a new model in which hLZ cooperates with complement to accelerate bacterial killing via promotion of the classical and alternative pathways activation as well as synergism with membrane-attack complex. LF does not inhibit bacterial killing by serum but can oppose hLZ and complement synergism in diluted serum.
Введение. Комплемент является ключевым гуморальным звеном иммунитета, участвующим в защитных и патологических процессах. Лизоцим человека (ЛЧ), лизоцим белка куриных яиц (ЛК) и лактоферрин (ЛФ) — классические компоненты врождённого иммунитета. Комплемент и белки врождённого иммунитета часто локализованы совместно, но их функциональное взаимодействие изучено недостаточно.
Целью работы было охарактеризовать функциональное взаимодействие ЛФ и лизоцимов с комплементом.
Материалы и методы. В качестве источника комплемента использовали сыворотку крови человека. В моделях классического и альтернативного путей комплемента использовали сенсибилизированные антителами эритроциты барана и эритроциты кролика соответственно. Уровень активации комплемента оценивали по гемолитической активности сыворотки, а также продукции анафилатоксинов, определяемых с помощью иммуноферментного анализа. Бактерицидное действие определяли методом подсчёта колоний. Проницаемость внешней и внутренней мембран Escherichia coli ML-35p изучали с использованием хромогенных субстратов периплазматических и цитоплазматических ферментов. Ферментативную активность лизоцима измеряли турбидиметрическим методом.
Результаты. Мы подтвердили данные о том, что ЛФ избирательно ингибирует классический путь (ИК50 ~ 160 мкг/мл; ~ 2 мкМ). Мы впервые продемонстрировали, что ЛЧ в высоких концентрациях (40–160 мкг/мл) умеренно усиливает активность классического и альтернативного путей комплемента (конвертацию белков C3, C5 и литическую активность), в то время как ЛК в концентрациях до 160 мкг/мл не влияет на активацию комплемента. ЛФ и ЛЧ модулировали классический путь независимо друг от друга. ЛФ не предотвращал киллинг E. coli сывороткой, но несколько повышал жизнеспособность бактерий в разбавленной сыворотке. Лизоцимы кооперировали с комплементом в киллинге бактерий, но ЛФ частично предотвращал это взаимодействие в 5% сыворотке. ЛЧ и ЛК ускоряли лизис внутренней мембраны сывороткой независимо от присутствия ЛФ. Эти два фермента усиливали бактерицидное действие 50% сыворотки, причём при добавлении ЛЧ были отмечены несколько лучшие результаты, чем в присутствии ЛК.
Заключение. ЛФ и ЛЧ оказывают противоположно направленное и независимое действие на комплемент. Мы уточняем представление о функциональном взаимодействии комплемента с лизоцимом и предлагаем новую модель, в которой лизоцим взаимодействует с комплементом для ускорения киллинга бактерий за счёт усиления классического и альтернативного путей, а также синергизма с мембраноатакующим комплексом. ЛФ не ингибирует уничтожение бактерий сывороткой, но может противодействовать синергизму лизоцима и комплемента в разбавленной сыворотке.