Journal of microbiology, epidemiology and immunobiologyJournal of microbiology, epidemiology and immunobiologyЖурнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии0372-93112686-7613Central Research Institute for Epidemiology1882810.36233/0372-9311-629KNLRDIORIGINAL RESEARCHESОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯResearch ArticleExperience of applying the metagenomic sequencing method on fragments of the 16S rRNA gene for the detection and identification of natural focal infection pathogensОпыт применения метода метагеномного секвенирования по фрагментам гена 16S рРНК для детекции и идентификации возбудителей природно-очаговых инфекцийhttps://orcid.org/0000-0002-8882-6477VasilievaOksana V.ВасильеваОксана Васильевна
Russian Federation

Cand. Sci. (Med.), Head, Laboratory for diagnostics of bacterial infections

кандидат мед. наук, зав. лаб. диагностики бактериальных инфекций

vasileva_ov@snipchi.ruhttps://orcid.org/0000-0001-7754-2201Ul’shinaDiana V.УльшинаДиана Васильевна
Russian Federation

Cand. Sci. (Biol.), senior researcher, Laboratory for diagnostics of bacterial infections

кандидат биол. наук, старший научный сотрудник лаб. диагностики бактериальных инфекций

vladidiana@yandex.ruhttps://orcid.org/0000-0001-5554-5882VolynkinaAnna S.ВолынкинаАнна Сергеевна
Russian Federation

Cand. Sci. (Biol.), Head, Laboratory for diagnostics of viral infections

кандидат биол. наук, зав. лаб. диагностики вирусных инфекций

volyn444@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0001-6458-6790PisarenkoSergey V.ПисаренкоСергей Владимирович
Russian Federation

Cand. Sci. (Chem.), leading researcher, Laboratory of biochemistry

кандидат хим. наук, ведущий научный сотрудник лаб. биохимии

pisarenko_sv@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0001-9442-6966SiritsaYulia V.СирицаЮлия Владимировна
Russian Federation

researcher, Laboratory for diagnostics of bacterial infections

научный сотрудник лаб. диагностики бактериальных инфекций

merendera@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0002-9044-1808GnusarevaOlga A.ГнусареваОльга Александровна
Russian Federation

researcher, Laboratory for diagnostics of bacterial infections

научный сотрудник лаб. диагностики бактериальных инфекций

gnusarevao@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0003-4353-4777YatsenkоNatalia A.ЯценкоНаталья Александровна
Russian Federation

Chief Physician

главный врач

natali.yanet@yandex.ruhttps://orcid.org/0000-0002-9362-3949KulichenkoAlexandr N.КуличенкоАлександр Николаевич
Russian Federation

Sci. (Med.), Professor, Аcademician of RAS, Director

доктор мед. наук, проф., академик РАН, директор

stavnipchi@mail.ruStavropol Plague Control Research InstituteСтавропольский противочумный институт РоспотребнадзораRegional Specialized Clinical Infectious Diseases HospitalКраевая специализированная клиническая инфекционная больница1205202510222012121005202510052025Copyright ©; 2025, Vasilieva O.V., Ul’shina D.V., Volynkina A.S., Pisarenko S.V., Siritsa Y.V., Gnusareva O.A., Yatsenkо N.A., Kulichenko A.N.Copyright ©; 2025, Васильева О.В., Ульшина Д.В., Волынкина А.С., Писаренко С.В., Сирица Ю.В., Гнусарева О.А., Яценко Н.А., Куличенко А.Н.2025Vasilieva O.V., Ul’shina D.V., Volynkina A.S., Pisarenko S.V., Siritsa Y.V., Gnusareva O.A., Yatsenkо N.A., Kulichenko A.N.Васильева О.В., Ульшина Д.В., Волынкина А.С., Писаренко С.В., Сирица Ю.В., Гнусарева О.А., Яценко Н.А., Куличенко А.Н.https://creativecommons.org/licenses/by/4.0https://microbiol.crie.ru/jour/article/view/18828

Introduction. Metagenomic sequencing is one of the most promising methods for both the detection and identification of natural focal infection (NFI) pathogens and for determining the species composition of various bacterial communities.

The aim is to detect and identify the NFI pathogens in samples of field and clinical material using metagenomic sequencing of 16S rRNA gene fragments, and to analyze the taxonomic composition of endosymbiotic microorganisms in the samples.

Materials and methods. Samples of field (14 samples) and clinical (2 samples) material with varying loads of DNA from NFI pathogens, determined by PCR (Borrelia burgdorferi sensu lato, Anaplasma phagocytophilum, Francisella tularensis, Rickettsia spp., Coxiella burnetii), were investigated. Amplification of fragments of the gene encoding 16S rRNA was performed using primers flanking the variable regions of the gene.

Results. In 14 out of 16 studied samples, target NFI pathogens were detected. The species identified included R. aeschlimannii (in 57.1% of positive samples), B. valaisiana (in 16.6%), F. tularensis (in 75%), C. burnetii (in 100%), and borreliae — pathogens of relapsing fevers (B. turcica, B. hispanica) were also found in one sample. The taxonomic structure of the microbiome of Ixodes ricinus, Dermacentor reticulatus, Rhipicephalus annulatus, Hyalomma aegyptium, Dermacentor marginatus ticks collected in the southern regions of the Russian Federation was studied. It was shown that the predominant microorganisms are representatives of the genera Flavobacterium, Pseudomonas, Serratia, Aeromonas, Pedobacter, Bradyrhizobium, Shingomonas. DNA markers of microorganisms — endosymbionts of ticks Candidatus Midichloria mitochondrii, representatives of the genera Rickettsiella, Coxiella, non-pathogenic and conditionally pathogenic species of the genus Francisella were found in pools of Ixodes ticks.

Conclusion. The effectiveness of the method of metagenomic sequencing of fragments of the 16S rRNA gene for the detection and identification of NFI pathogens in samples of clinical and field material was demonstrated. Metagenomic sequencing of 16S rRNA gene regions can be recommended as an additional laboratory method for detecting and identifying NFI pathogens.

Введение. Метагеномное секвенирование — один из наиболее перспективных методов как для детекции и идентификации возбудителей природно-очаговых инфекций (ПОИ), так и для определения видовой структуры различных бактериальных сообществ.

Цель работы — выполнить детекцию и идентификацию возбудителей ПОИ в образцах полевого и клинического материала методом метагеномного секвенирования фрагментов гена 16S рРНК, проанализировать таксономический состав эндосимбиотических микроорганизмов в образцах.

Материалы и методы. Исследованы образцы полевого (14 проб) и клинического (2 пробы) материала с различной нагрузкой ДНК возбудителей ПОИ, определённой методом полимеразной цепной реакции (Borrelia burgdorferi sеnsu lato, Anaplasma phagocytophilum, Francisella tularensis, Rickettsia spp., Coxiella burnetii). Амплификацию фрагментов гена, кодирующего 16S рРНК, осуществляли с помощью праймеров, фланкирующих вариабельные участки гена.

Результаты. В 14 из 16 исследуемых образцов детектированы целевые возбудители ПОИ. До вида идентифицированы R. aeschlimannii (в 57,1% положительных образцов), B. valaisiana (в 16,6%), F. tularensis (в 75%), C. burnetii (в 100%), также в одном образце выявлены боррелии — возбудители возвратных лихорадок (B. turcica, B. hispanica). Исследована таксономическая структура микробиома клещей Ixodes ricinus, Dermacentor reticulatus, Rhipicephalus annulatus, Hyalomma aegyptium, Dermaceptor marginatus, собранных в южных регионах России. Выявлено, что преобладающие микроорганизмы — это представители родов Flavobacterium, Pseudomonas, Serratia, Aeromonas, Pedobacter, Bradyrhizobium, Shingomonas. В пулах иксодовых клещей обнаружены ДНК-маркеры микроорганизмов — эндосимбионтов клещей Candidatus Midichloria mitochondrii, представителей родов Rickettsiella, Coxiella, непатогенных и условно-патогенных для человека видов родов Francisella.

Заключение. Показана эффективность метода метагеномного секвенирования фрагментов гена 16S pРНК для детекции и идентификации возбудителей ПОИ в пробах клинического и полевого материала. Метагеномное секвенирование по участкам гена 16S pРНК может быть рекомендовано в качестве дополнительного метода лабораторного исследования образцов с целью детекции и идентификации возбудителей ПОИ.

metagenomic sequencing16S rRNAnatural focal infectionsdetectionidentificationmicrobiomeметагеномное секвенирование16S рРНКприродно-очаговые инфекциидетекцияидентификациямикробиомРудаков Н.В., Ястребов В.К. Эволюция учения о природной очаговости болезней человека. Эпидемиология и инфекционные болезни. Актуальные вопросы. 2014;(4):4–8. Rudakov N.V., Yastrebov V.K. Evolution of teaching of the natural nidality of human diseases. Epidemiology and Infectious Diseases. Current Items. 2014;(4):4–8. EDN: https://elibrary.ru/swnymzЯстребов В.К. Клещевой энцефалит в Сибири: эпидемиология, сочетанность природных очагов. Бюллетень Сибирского отделения Российской академии медицинских наук. 2007;27(4):89–93. Yastrebov V.K. Tick-borne encephalitis in Siberia: epidemiology, combined natural foci. Bulletin of Siberian Medicine. 2007;27(4):89–93. EDN: https://elibrary.ru/pjdxjpСмелянский В.П., Жуков К.В., Бородай Н.В. и др. Современное состояние проблемы природно-очаговых инфекций на территории Волгоградской области. Здоровье населения и среда обитания – ЗНиСО. 2021;29(11):83–93. Smelyаnsky V.P., Zhukov K.V., Borodаi N.V., et al. The problem of natural focal infectious diseases in the Volgograd region: a state-of-the-art review. Public Health and Life Environment — PH&LE. 2021;29(11):83–93. DOI: https://doi.org/10.35627/2219-5238/2021-29-11-83-93 EDN: https://elibrary.ru/qrtwmiИстомин А.В. Региональный мониторинг природно-очаговых инфекций. Псковский регионологический журнал. 2006;(1):122–35. Istomin A.V. Regional monitoring over natural-focal infections. Pskov Regionology Journal. 2006;(1):122–35. EDN: https://elibrary.ru/nuhqfdДемидова Т.Н., Шарапова Н.Е., Горшенко В.В. и др. Эпидемиологическое проявление сочетанных природных очагов туляремии, лептоспирозов и геморрагической лихорадки с почечным синдромом: микстинфекции. Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2022;21(2):38–45. Demidova T.N., Sharapova N.E., Gorshenko V.V., et al. Epidemiological manifestation of combined natural foci of tularemia, leptospirosis and hemorrhagic fever with renal syndrome: mixed infections. Epidemiology and Vaccinal Prevention. 2022;21(2):38–45. DOI: https://doi.org/10.31631/2073-3046-2022-21-2-38-45 EDN: https://elibrary.ru/fsnrdvКоренберг Э.И. Изучение и профилактика микст-инфекций, передающихся иксодовыми клещами. Вестник Российской академии медицинских наук. 2001;(11):41–5. Korenberg E.I. The study and prevention of mixed infections transmitted by ticks. Annals of the Russian Academy of Medical Sciences. 2001;(11):41–5.Шкарин В.В., Благонравова А.С., Чумаков М.Э. Эпидемиологические особенности сочетанных природно-очаговых инфекций. Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2017;16(5):43–52. Shkarin V.V., Blagonravova A.S., Chumakov E.M. Epidemiological features of combined natural-focal infections. Epidemiology and Vaccinal Prevention. 2017;16(5):43–52. EDN: https://elibrary.ru/zqolrvKingry L., Sheldon S., Oatman S., et al. Targeted metagenomics for clinical detection and discovery of bacterial tick-borne pathogens. J. Clin. Microbiol. 2020;58(11):e00147–20. DOI: https://doi.org/10.1128/JCM.00147-20Handelsman J., Rondon M.R., Brady S.F., et al. Molecular biological access to the chemistry of unknown soil microbes: a new frontier for natural products. Chem. Biol. 1998;5(10):R245–9. DOI: https://doi.org/10.1016/s1074-5521(98)90108-9Thoendel M. Targeted metagenomics offers insights into potential tick-borne pathogens. J. Clin. Microbiol. 2020;58(11):e01893–20. DOI: https://doi.org/10.1128/JCM.01893-20Ghosh A., Mehta A., Khan A.M. Metagenomic analysis and its applications. In: Encyclopedia of Bioinformatics and Computational Biology. Volume 3. Elsevier;2019:184–93. DOI: https://doi.org/10.1016/B978-0-12-809633-8.20178-7Rodino K.G., Wolf M.J., Sheldon S., et al. Detection of tick-borne bacteria from whole blood using 16S ribosomal RNA gene PCR followed by next-generation sequencing. J. Clin. Microbiol. 2021;59(5):e03129-20. DOI: https://doi.org/10.1128/jcm.03129-20Carpi G., Cagnacci F., Wittekindt N.E., et al. Metagenomic profile of the bacterial communities associated with Ixodes ricinus ticks. PloS One. 2011;6(10):e25604. DOI: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0025604Kumar P.S., Brooker M.R., Dowd S.E., Camerlengo T. Target region selection is a critical determinant of community fingerprints generated by 16S pyrosequencing. PloS One. 2011;6(6):e20956. DOI: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0020956Takhampunya R., Korkusol A., Pongpichit C., et al. Metagenomic approach to characterizing disease epidemiology in a disease-endemic environment in Northern Thailand. Front. Microbiol. 2019;10:319. DOI: https://doi.org/10.3389/fmicb.2019.00319Филлипова Н.А. Иксодовые клещи подсем. Amblyomminae. В кн.: Фауна России и сопредельных стран. Паукообразные. СПб.;1997. Filippova N.A. Ixodidae ticks of Amblyomminae subfamily. In: Fauna of Russia and Bordering Countries. Arachnids. St. Petersburg;1997.Mediannikov O., Diatta G., Fenollar F., et al. Tick-borne rickettsioses, neglected emerging diseases in rural Senegal. PLoS Negl. Trop. Dis. 2010;4(9):e821. DOI: https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0000821Abellan-Schneyder I., Matchado M.S., Reitmeier S., et al. Primer, pipelines, parameters: issues in 16S rRNA gene sequencing. mSphere 2021;6(1):e01202–20. DOI: https://doi.org/10.1128/mSphere.01202-20Dobin A., Davis C.A., Schlesinger F., et al. STAR: Ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 2013;29(1):15–21. DOI: https://doi.org/10.1093/bioinformatics/bts635Salter S.J., Cox M.J., Turek E.M., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biol. 2014;12:87. DOI: https://doi.org/10.1186/s12915-014-0087-zKeller A., Graefen A., Ball M., et al. New insights into the Tyrolean Iceman's origin and phenotype as inferred by whole-genome sequencing. Nat. Commun. 2012;3:698. DOI: https://doi.org/10.1038/ncomms1701Mayne P.J. Emerging incidence of Lyme borreliosis, babesiosis, bartonellosis, and granulocytic ehrlichiosis in Australia. Int. J. Gen. Med. 2011;4:845–52. DOI: https://doi.org/10.2147/IJGM.S27336Krause P.J., Telford S.R., Spielman A., et al. Concurrent Lyme disease and babesiosis. Evidence for increased severity and duration of illness. JAMA. 1996;275(21):1657–60.Belongia E.A. Epidemiology and impact of coinfections acquired from Ixodes ticks. Vector Borne Zoonotic Dis. 2002;2(4):265–73. DOI: https://doi.org/10.1089/153036602321653851Курильщиков А.М., Ливанова Н.Н., Фоменко Н.В., Тикунова Н.В. Метагеномный анализ бактериального сообщества, ассоциированного с клещами Ixodes persulcatus. Вестник Новосибирского государственного университета. Серия: Биология, клиническая медицина. 2013;11(4):13–21. Kurilchshikov A.M., Livanova N.N., Fomenko N.V., Tikunova N.V. Metagenomic analysis of bacterial community associated with Ixodes persulcatus ticks. Vestnik NSU. Series: Biology and Clinical Medicine. 2013;11(4):13–21. EDN: https://elibrary.ru/rtukuxNorte A. C., Harris D. J., Silveira D., et al. Diversity of microorganisms in Hyalomma aegyptium collected from spur‐thighed tortoise (Testudo graeca) in North Africa and Anatolia. Transbound. Emerg. Dis. 2022;69(4):1951–62. DOI: https://doi.org/10.1111/tbed.14188Akveran G.A., Karasartova D., Keskin A., et al. Bacterial and protozoan agents found in Hyalomma aegyptium (L., 1758) (Ixodida: Ixodidae) collected from Testudo graeca L., 1758 (Reptilia: Testudines) in Corum Province of Turkey. Ticks Tick Borne Dis. 2020;11(5):101458. DOI: https://doi.org/10.1016/j.ttbdis.2020.101458Benyahia H., Diarra A.Z., Gherissi D.E., et al. Molecular and MALDI-TOF MS characterisation of Hyalomma aegyptium ticks collected from turtles and their associated microorganisms in Algeria. Ticks Tick Borne Dis. 2022;13(1)101858. DOI: https://doi.org/10.1016/j.ttbdis.2021.101858Kalmár Z., Cozma V., Sprong H., et al. Transstadial transmission of Borrelia turcica in Hyalomma aegyptium ticks. PLoS One. 2015;10(2):e0115520. DOI: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0115520Hepner S., Fingerle V., Duscher G.G., et al. Population structure of Borrelia turcica from Greece and Turkey. Infect. Genet. Evol. 2020; 77:104050. DOI: https://doi.org/10.1016/j.meegid.2019.104050Barbour A.G., Gupta R.S. The family Borreliaceae (Spirochaetales), a diverse group in two genera of tick-borne spirochetes of mammals, birds, and reptiles. J. Med. Entomol. 2021;58(4):1513–24. DOI: https://doi.org/10.1093/jme/tjab055Abdelbaset A.E., Nonaka N., Nakao R. Tick-borne diseases in Egypt: a one health perspective. One Health. 2022;15:100443. DOI: https://doi.org/10.1016/j.onehlt.2022.100443Moraga-Fernández A., Muñoz-Hernández C., Sánchez-Sánchez M., et al. Exploring the diversity of tick-borne pathogens: the case of bacteria (Anaplasma, Rickettsia, Coxiella and Borrelia) protozoa (Babesia and Theileria) and viruses (Orthonairovirus, tick-borne encephalitis virus and louping ill virus) in the European continent. Vet. Microbiol. 2023;286:109892. DOI: https://doi.org/10.1016/j.vetmic.2023.109892Carpi G., Cagnacci F., Wittekindt N.E., et al. Metagenomic profile of the bacterial communities associated with Ixodes ricinus ticks. PloS One. 2011;6(10):e25604. DOI: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0025604Plummer E., Twin J., Bulach D.M., et al. A comparison of three bioinformatics pipelines for the analysis of preterm gut microbiota using 16S rRNA gene sequencing data. J. Proteomics Bioinform. 2015;8(12):283–91. DOI: https://doi.org/10.4172/jpb.1000381Pinna N.K., Dutta A., Monzoorul Haque M., Mande S.S. Can targeting non-contiguous V-regions with paired-end sequencing improve 16S rRNA-based taxonomic resolution of microbiomes?: an in silico evaluation. Front. Genet. 2019;10:653. DOI: https://doi.org/10.3389/fgene.2019.00653Bukin Y.S., Galachyants Y.P., Morozov I.V., et al. The effect of 16S rRNA region choice on bacterial community metabarcoding results. Sci. Data. 2019;6:190007. DOI: https://doi.org/10.1038/sdata.2019.7Martinez-Porchas M., Villalpando-Canchola E., Ortiz Suarez L.E., Vargas-Albores F. How conserved are the conserved 16S-rRNA regions? PeerJ. 2017;5:e3036. DOI: https://doi.org/10.7717/peerj.3036Barb J.J., Oler A.J., Kim H.S., et al. Development of an analysis pipeline characterizing multiple hypervariable regions of 16S rRNA using mock samples. PLoS One. 2016;11(2):e0148047. DOI: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0148047Hiergeist A., Reischl U., Gessner A. Multicenter quality assessment of 16S ribosomal DNA-sequencing for microbiome analyses reveals high inter-center variability. Int. J. Med. Microbiol. 2016;306(5):334–42. DOI: https://doi.org/10.1016/j.ijmm.2016.03.005Takahashi S., Tomita J., Nishioka K., et al. Development of a prokaryotic universal primer for simultaneous analysis of Bacteria and Archaea using next-generation sequencing. PLoS One. 2014;9(8):e105592. DOI: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0105592Yang B., Wang Y., Qian P.Y. Sensitivity and correlation of hypervariable regions in 16S rRNA genes in phylogenetic analysis. BMC Bioinformatics. 2016;17:135. DOI: https://doi.org/10.1186/s12859-016-0992-y