Journal of microbiology, epidemiology and immunobiologyJournal of microbiology, epidemiology and immunobiologyЖурнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии0372-93112686-7613Central Research Institute for Epidemiology1880210.36233/0372-9311-620ppmxdeSCIENCE AND PRACTICEНАУКА И ПРАКТИКАResearch ArticlePreparation of conjugates based on colloidal gold nanoparticles for application in rapid detection of antibodies to hepatitis E virusПолучение конъюгатов на основе наночастиц коллоидного золота для быстрого выявления антител к вирусу гепатита Еhttps://orcid.org/0000-0001-9887-4061AlatortsevaGalina I.АлаторцеваГалина Ивановна
Russian Federation

Cand. Sci. (Biol.), Head, Laboratory of cloning of viral genomes, Virology department named after O.G. Andzhaparidze

канд. биол. наук, зав. лаб. клонирования вирусных геномов отдела вирусологии им. О.Г. Анджапаридзе

alatortseva@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0002-3825-3906NesterenkoLyubov N.НестеренкоЛюбовь Николаевна
Russian Federation

Cand. Sci. (Chem.), leading researcher, Laboratory of cloning of viral genomes, Virology department named after O.G. Andzhaparidze

канд. хим. наук, в. н. с. лаб. клонирования вирусных геномов отдела вирусологии им. О.Г. Анджапаридзе

innesterenko3001@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0003-3483-0128AmiantovaIrina I.АмиантовaИрина Ильинична
Russian Federation

researcher, Laboratory of cloning of viral genomes, Virology department named after O.G. Andzhaparidze

н. с. лаб. клонирования вирусных геномов отдела вирусологии им. О.Г. Анджапаридзе

amianti@yandex.ruhttps://orcid.org/0000-0002-2997-8892PritvorovaLyudmila N.ПритвороваЛюдмила Николаевна
Russian Federation

Cand. Sci. (Med.), leading researcher, Laboratory of cloning of viral genomes, Virology department named after O.G. Andzhaparidze

канд. мед. наук, в. н. с. лаб. клонирования вирусных геномов отдела вирусологии им. О.Г. Анджапаридзе

lexx294@yandex.byhttps://orcid.org/0000-0002-5866-944XDotsenkoVera V.ДоценкоВера Васильевна
Russian Federation

Cand. Sci. (Biol.), senior researcher, Laboratory of cloning of viral genomes, Virology department named after O.G. Andzhaparidze

канд. биол. наук, с. н. с. лаб. клонирования вирусных геномов отдела вирусологии им. О.Г. Анджапаридзе

verramal@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0002-0017-1892ZverevVitaly V.ЗверевВиталий Васильевич
Russian Federation

D. Sci. (Biol.), Professor, RAS Full Member, Head, Virology department named after O.G. Andzhaparidze, scientific director

д-р биол. наук, профессор, академик РАН, зав. отделом вирусологии им. О.Г. Анджапаридзе, научный руководитель

vitalyzverev@outlook.comhttps://orcid.org/0000-0003-1757-8389SvitichOksana A.СвитичОксана Анатольевна
Russian Federation

D. Sci. (Med.), Corresponding Member of the RAS, Head, Immunology and Allergology department, Director

д-р мед. наук, член-корр. РАН, зав. отделом иммунологии и аллергологии, директор

svitichoa@yandex.ruI. Mechnikov Research Institute of Vaccine and SeraНаучно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова3003202510217173003202530032025Copyright ©; 2025, Alatortseva G.I., Nesterenko L.N., Amiantova I.I., Pritvorova L.N., Dotsenko V.V., Zverev V.V., Svitich O.A.Copyright ©; 2025, Алаторцева Г.И., Нестеренко Л.Н., Амиантовa И.И., Притворова Л.Н., Доценко В.В., Зверев В.В., Свитич О.А.2025Alatortseva G.I., Nesterenko L.N., Amiantova I.I., Pritvorova L.N., Dotsenko V.V., Zverev V.V., Svitich O.A.Алаторцева Г.И., Нестеренко Л.Н., Амиантовa И.И., Притворова Л.Н., Доценко В.В., Зверев В.В., Свитич О.А.https://creativecommons.org/licenses/by/4.0https://microbiol.crie.ru/jour/article/view/18802

Relevance. Hepatitis E virus (HEV) is a common cause of viral hepatitis not only in areas with low levels of water supply and hygiene, but also in industrialized countries. Rapid tests development for the infection seromarkers detection in the absence of special equipment and trained staff remains the most important problem in improving the diagnosis of hepatitis E.

Aim. To produce conjugates of recombinant ORF2 antigen of HEV genotype 3 with gold nanoparticles (GNP) of varied sizes and to evaluate their applicability in the immunoassay for the detection of antibodies to HEV.

Materials and methods. Specific polyclonal and monoclonal antibodies, recombinant antigen ORF2 of hepatitis E virus genotype 3, blood serum samples of people diagnosed with acute hepatitis. Synthesis of GNPs and their conjugates with recombinant antigen, enzyme immunoassay, dot immunoassay, immunochromatographic analysis, transmission electron microscopy.

Results. Three samples of colloidal GNP were synthesized using citrate method with varied concentrations of reducing agent and were subsequently used for preparation of conjugates with recombinant antigen ORF2 of HEV genotype 3. Immunoreactivity of these conjugates was confirmed by dot-immunoassay with blood serum samples containing specific IgG. A conjugate based on a 41 nm GNP was chosen for use in immunochromatographic analysis (ICA). Optimal conditions for preparation of a multi-membrane composite, including formation of analytical and control lines and the conjugate area were identified, and test strips were developed. The obtained conjugate was tested by ICA using blood serum samples which had been subjected to preliminarily characterization by the content of the IgG antibody to HEV. High immunoreactivity of the conjugate was demonstrated. Antibodies to the virus were identified in 100% of the examined (n = 17) IgG-positive serum samples, while in negative samples (n = 17) they were absent.

Conclusion. The results demonstrated effectiveness of the obtained immunoreagents (recombinant antigen, antibodies, conjugate) for use in test-systems for rapid diagnosis of hepatitis E.

Актуальность. Вирус гепатита Е (ВГЕ) — частая причина вирусных гепатитов не только на территориях с низким уровнем водоснабжения и гигиены, но и в промышленно развитых странах. Важнейшей проблемой совершенствования системы диагностики гепатита Е остаётся разработка тестов быстрого определения серомаркеров инфекции для применения в условиях отсутствия специального оборудования и обученного персонала.

Цель работы — получение конъюгатов наночастиц коллоидного золота (НЧЗ) нескольких размеров с рекомбинантным антигеном ORF2 ВГЕ 3-го генотипа и оценка возможности их применения в иммуноанализе для выявления антител к ВГЕ.

Материалы и методы. Исследовали специфические поликлональные и моноклональные антитела, рекомбинантный антиген ORF2 ВГЕ 3-го генотипа, образцы сывороток крови людей с диагнозом острого гепатита. Осуществляли синтез НЧЗ и их конъюгатов с рекомбинантным антигеном, иммуноферментный анализ, дот-иммуноанализ, иммунохроматографический анализ, использовали метод просвечивающей электронной микроскопии.

Результаты. Цитратным методом с использованием различных концентраций восстановителя синтезированы 3 препарата НЧЗ. На их основе получены конъюгаты с рекомбинантным антигеном ORF2 ВГЕ 3-го генотипа, иммунореактивность которых подтверждена методом дот-иммуноанализа с образцами сывороток крови, содержащими специфические иммуноглобулины класса G (IgG). Для применения в иммунохроматографическом анализе отобран конъюгат на основе НЧЗ диаметром 41 нм. Отработаны условия получения мультимембранного композита, включая формирование аналитической и контрольной линий и зоны конъюгата, изготовлены тест-полоски и проведены испытания полученного конъюгата методом иммунохроматографического анализа с образцами сывороток крови, предварительно охарактеризованными по содержанию IgG-антител к ВГЕ. Показана высокая иммунореактивность полученного конъюгата: антитела к вирусу выявлены в 100% обследованных IgG-положительных проб сывороток (n = 17) и не обнаружены в отрицательных пробах (n = 17).

Выводы. Получены иммунореагенты (рекомбинантный антиген, антитела, конъюгат), которые могут быть использованы при создании тест-систем для экспресс-диагностики ВГЕ.

immunochromatographic assaycolloidal gold nanoparticlesrecombinant antigenhepatitis E virusprotein ORF2IgGиммунохроматографический анализнаночастицы коллоидного золотарекомбинантный антигенвирус гепатита Ебелок ORF2иммуноглобулины класса GThomas D.L., Yarbough P.O., Vlahov D., et al. Seroreactivity to hepatitis E virus in areas where the disease is not endemic. J Clin. Microbiol. 1997;35(5):1244–7. DOI: https://doi.org/10.1128/jcm.35.5.1244-1247.1997EASL Clinical Practice Guidelines on hepatitis E virus infection. J. Hepatol. 2018;68(6):1256–71. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jhep.2018.03.005Takahashi M., Kusakai S., Mizuo H., et al. Simultaneous detection of immunoglobulin A (IgA) and IgM antibodies against hepatitis E virus (HEV) is highly specific for diagnosis of acute HEV infection. J. Clin. Microbiol. 2005;43(1):49–56. DOI: https://doi.org/10.1128/jcm.43.1.49-56.2005Chandra N.S., Sharma A., Malhotra B., Rai R.R. Dynamics of HEV viremia, fecal shedding and its relationship with transaminases and antibody response in patients with sporadic acute hepatitis E. Virol. J. 2010;7:213. DOI: https://doi.org/10.1186/1743-422X-7-213Chionne P., Madonna E., Pisani G., et al. Evaluation of rapid tests for diagnosis of acute hepatitis E. J. Clin. Virol. 2016;78:4–8. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jcv.2016.02.005Rosi N.L., Mirkin C.A. Nanostructures in biodiagnostics. Chem. Rev. 2005;105(4):1547–62. DOI: https://doi.org/10.1021/cr030067fJans H., Huo Q. Gold nanoparticle-enabled biological and chemical detection and analysis. Chem. Soc. Rev. 2012;41(7):2849–66. DOI: https://doi.org/10.1039/c1cs15280gDykman L.A., Bogatyrev V.A. Colloidal gold in solid-phase analysis. Biochemistry (Moscow). 1997;62(4):350–6. EDN: https://elibrary.ru/leawarWilson R. The use of gold nanoparticles in diagnostics and detection. Chem. Soc. Rev. 2008;37(9):2028–45. DOI: https://doi.org/10.1039/b712179mMulvaney P. Surface plasmon spectroscopy of nanosized metal particles. Langmuir. 1996;12(3):788–800. DOI: https://doi.org/10.1021/la9502711Wilson R. The use of gold nanoparticles in diagnostics and detection. Chem. Soc. Rev. 2008;37(9):2028–45. DOI: https://doi.org/10.1039/b712179mFrens G. Controlled nucleation for the regulation of the particle size in monodisperse gold suspensions. Nature Phys. Sci. 1973;241(105):20–2. DOI: https://doi.org/10.1038/physci241020a0Park J.W., Shumaker-Parry J.S. Structural study of citrate layers on gold nanoparticles: Role of intermolecular interactions in stabilizing nanoparticles. J. Am. Chem. Soc. 2014;136(5):1907–21. DOI: https://doi.org/10.1021/ja4097384Сафронова В.А., Самсонова Ж.В., Григоренко В.Г., Осипов А.П. Определение прогестерона методом латерального проточного иммуноанализа. Вестник Московского университета. Серия 2: Химия. 2012;53(5):326–34. EDN: https://elibrary.ru/puirof Safronova V.A., Samsonova J.V., Grigorenko V.G., Osipov A.P. Lateral flow immunoassay for progesterone detection. Moscow University Chemistry Bulletin. 2012;67(5):241–8. DOI: https://doi.org/10.3103/S0027131412050045 EDN: https://elibrary.ru/rgicvfАлаторцева Г.И., Сидоров А.В., Нестеренко Л.Н. и др. Разработка рекомбинантного белка капсида вируса гепатита Е третьего генотипа: клонирование, экспрессия, очистка, оценка антигенных свойств. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2019;96(1):10–7. Alatortseva G.I., Sidorov A.V., Nesterenko L.N., et al. Development of hepatitis E 3 genotype recombinant protein capsid of: cloning, expression, purification, evaluation of the antigenic properties. Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology. 2019;96(1):10–7. DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-2019-1-10-17 EDN: https://elibrary.ru/hmyroiKhuroo M.S., Khuroo M.S., Khuroo N.S. Hepatitis E: Discovery, global impact, control and cure. World J. Gastroenterol. 2016;22(31):7030–45. DOI: https://doi.org/10.3748/wjg.v22.i31.7030Kamar N., Izopet J., Pavio N., et al. Hepatitis E virus infection. Nat. Rev. Dis. Primers. 2017;3:17086. DOI: https://doi.org/10.1038/nrdp.2017.86Mikhailov M.I., Karlsen A.A., Potemkin I.A., et al. Geographic and temporal variability of hepatitis E virus circulation in the Russian Federation. Viruses. 2022;15(1):37. DOI: https://doi.org/10.3390/v15010037Алаторцева Г.И., Сидоров А.В., Нестеренко Л.Н. и др. Рекомбинантный белок, содержащий антигенно-значимые фрагменты белков вируса гепатита Е, используемый в тест-системах для серодиагностики гепатита Е (варианты). Патент РФ 2711907 С2;2020. Alatortseva G.I., Sidorov A.V., Nesterenko L.N., et al. Recombinant protein containing antigen-significant fragments of hepatitis E virus proteins, used in test systems for hepatitis E serodiagnosis (embodiments). Patent RU № 2711907 C2;2020.Nakane P.K., Kawaoi A. Peroxidase-labeled antibody. A new method of conjugation. J. Histochem. Cytochem. 1974;22(12):1084–91. DOI: https://doi.org/10.1177/22.12.1084Алаторцева Г.И., Лухверчик Л.Н., Нестеренко Л.Н. и др. Определение доли гепатита Е в этиологической структуре острых вирусных гепатитов в отдельных регионах Кыргызстана. Клиническая лабораторная диагностика. 2019;64(12):740–6. Alatortseva G.I., Lukhverchik L.N., Nesterenko L.N., et al. The estimation of the hepatitis E proportion in the etiological structure of acute viral hepatitis in certain regions of of Kyrgyzstan. Clinical Laboratory Diagnostics. 2019;64(12):740–6. DOI: https://doi.org/10.18821/0869-2084-2019-64-12-740-746 EDN: https://elibrary.ru/ptiyxmДавыдов В.В., Жаворонок С.В., Рогачева Т.А. и др. Распространённость антител к вирусу гепатита Е у населения регионов Республики Беларусь. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2022;99(2):160–71. Davydov V.V., Zhavoronok S.V., Rogacheva T.A., et al. Prevalence of antibodies to the hepatitis E virus in the population of the Republic of Belarus. Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology. 2022;99(2):160–71. DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-236 EDN: https://elibrary.ru/wpzhlfАлаторцева Г.И., Доценко В.В., Нестеренко Л.Н. и др. Тест-система для выявления IgG-антител к вирусу гепатита Е (Hepeviridae, Orthohepevirus, Orthohepevirus A) методом линейного иммуноанализа. Вопросы вирусологии. 2020;65(3):132–42. Alatortseva G.I., Dotsenko V.V., Nesterenko L.N., et al. Line immunoassay for detection of IgG antibodies to hepatitis E virus (Hepeviridae, Orthohepevirus, Orthohepevirus A). Problems of Virology. 2020;65(3):132–42. DOI: https://doi.org/10.36233/0507-4088-2020-65-3-132-142 EDN: https://elibrary.ru/svgsmaDe Mey J., Moeremans M. The preparation of colloidal gold probes and their use as marker in electron microscopy. In: Koehler, J.K., eds. Advanced Techniques in Biological Electron Microscopy III. Berlin, Heidelberg; 1986: 229–71. DOI: https://doi.org/10.1007/978-3-642-71135-0_6Yao N., Wang Z.L., ed. Handbook of Microscopy for Nanotechnology. Boston; 2006.Сотников Д.В. Определение специфических антител методом иммунохроматографии: количественные закономерности и практические приложения: Автореф. дисс. … канд. хим. наук. М.;2016. Sotnikov D.V. Determination of specific antibodies by immunochromatography: quantitative patterns and practical applications: Diss. Moscow;2016.Дыкман Л.А., Богатырев В.А. Наночастицы золота: получение, функционализация, использование в биохимии и иммунохимии. Успехи химии. 2007;76(2):199–213. EDN: https://elibrary.ru/knoucz Dykman L.A., Bogatyrev V.A. Gold nanoparticles: preparation, functionalisation and applications in biochemistry and immunochemistry. Russian Chemical Reviews. 2007;76(2):181–94. DOI: https://doi.org/10.1070/RC2007v076n02ABEH003673 EDN: https://elibrary.ru/lkoyxrБогачева Н.В., Смирнова Д.Н., Дармов И.В., Крупина К.А. Способ получения наночастиц коллоидного золота со средним диаметром 25-30 нм. Патент РФ 2644466 C2;2016. Bogacheva N.V., Smirnova D.N., Darmov I.V., Krupina K.A. Method for obtaining nanoparticles of colloid gold with average diameter 25–30 nm. Patent RU 2644466 C2;2016. EDN: https://elibrary.ru/ckmfydZaraysky E.I. Nanogold and its conjugates in immunochromatography: synthesis, analysis, separation, conjugation with macromolecules. Eurasian Union of Scientists. 2018;(12-3):42–7. DOI: https://doi.org/10.31618/ESU.2413-9335.2018.3.57.42-47 EDN: https://elibrary.ru/csxzyvKumar D., Mutreja I., Sykes P. Seed mediated synthesis of highly mono-dispersed gold nanoparticles in the presence of hydroquinone. Nanotechnology. 2016;27(35):355601. DOI: https://doi.org/10.1088/0957-4484/27/35/355601Mori T., Hegmann T. Determining the composition of gold nanoparticles: a compilation of shapes, sizes, and calculations using geometric considerations. J. Nanopart. Res. 2016; 18(10):295. DOI: https://doi.org/10.1007/s11051-016-3587-7Rajasekharreddy P., Usha Rani P., Sreedhar B. Qualitative assessment of silver and gold nanoparticle synthesis in various plants: a photobiological approach. J. Nanopart. Res. 2010;12:1711–21. DOI: https://doi.org/10.1007/s11051-010-9894-5Safenkova I., Zherdev A., Dzantiev B. Factors influencing the detection limit of the lateral-flow sandwich immunoassay: a case study with potato virus X. Anal. Bioanal. Chem. 2012;403(6):1595–605. DOI: https://doi.org/10.1007/s00216-012-5985-8Бызова Н.А., Сафенкова И.В., Жердев А.В., Дзантиев Б.Б. Сравнительная характеристика наночастиц коллоидного золота разного диаметра как носителей и маркеров в иммунохроматографическом анализе. Естественные и технические науки. 2012;(1):62–71. Byzova N.A., Safenkova I.V., Zherdev A.V., Dzantiev B.B. A comparative analysis of colloidal gold nanoparticles of various diameters as carriers and markers in immunochromatographic assay. Natural and Technical Sciences. 2012;(1):62–71. EDN: https://elibrary.ru/owmcqxByzova N.A., Zvereva E.A., Zherdev A.V., et al. Rapid pretreatment-free immunochromatographic assay of chloramphenicol in milk. Talanta. 2010;81(3):843–8. DOI: https://doi.org/10.1016/j.talanta.2010.01.025Kaur K., Forrest J.A. Influence of particle size on the binding activity of proteins adsorbed onto gold nanoparticles. Langmuir. 2012;28(5):2736–44. DOI: https://doi.org/10.1021/la203528uSotnikov D.V., Zherdev A.V., Dzantiev B.B. Development and application of a label-free fluorescence method for determining the composition of gold nanoparticle-protein conjugates. Int. J. Mol. Sci. 2014;16(1):907–23. DOI: https://doi.org/10.3390/ijms16010907Al-Sadeq D.W., Majdalawieh A.F., Mesleh A.G., et al. Laboratory challenges in the diagnosis of hepatitis E virus. J. Med. Microbiol. 2018;67(4):466–80. DOI: https://doi.org/10.1099/jmm.0.000706Chakraborty S., Joshi P., Shanker V., et al. Contrasting effect of gold nanoparticles and nanorods with different surface modifications on the structure and activity of bovine serum albumin. Langmuir. 2011;27(12):7722–31. DOI: https://doi.org/10.1021/la200787t