Journal of microbiology, epidemiology and immunobiologyJournal of microbiology, epidemiology and immunobiologyЖурнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии0372-93112686-7613Central Research Institute for Epidemiology1875510.36233/0372-9311-643ONKJVEORIGINAL RESEARCHESОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯResearch ArticleStudy of the protective properties of immunodominant proteins of orthopoxviruses in various methods of immunizationИсследование протективных свойств иммунодоминантных белков ортопоксвирусов при различных способах иммунизацииhttps://orcid.org/0000-0003-0899-8357ZrelkinDenis I.ЗрелкинДенис Игоревич
Russian Federation

junior researcher, Laboratory of immunobiotechnology

м. н. с. лаб. иммунобиотехнологии

aleza4striker@yandex.ruhttps://orcid.org/0000-0001-7893-8419ZubkovaOlga V.ЗубковаОльга Вадимовна
Russian Federation

Cand. Sci. (Biol.), leading researcher, Laboratory of immunobiotechnology

канд. биол. наук, в. н. с. лаб. иммунобиотехнологии

olga-zubkova@yandex.ruhttps://orcid.org/0000-0001-7147-1553OzharovskaiaTatiana A.ОжаровскаяТатьяна Андреевна
Russian Federation

Cand. Sci. (Biol.), senior researcher, Laboratory of immunobiotechnology

канд. биол. наук, с. н. с. лаб. иммунобиотехнологи

t.ozh@yandex.ruhttps://orcid.org/0000-0003-3248-1227PopovaOlgaПоповаОльга
Russian Federation

junior researcher, Laboratory of immunobiotechnology

м. н. с. лаб. иммунобиотехнологии

olga.popova31@yandex.ruhttps://orcid.org/0000-0001-6629-744XVoroninaDaria V.ВоронинаДарья Владимировна
Russian Federation

junior researcher, Laboratory of immunobiotechnology

м. н. с. лаб. иммунобиотехнологии

daryavoronin2009@yandex.ruhttps://orcid.org/0009-0000-1965-0482GoldovskayaPolina P.ГолдовскаяПолина Павловна
Russian Federation

laboratory assistant researcher, Laboratory of immunobiotechnology

лаборант-исследователь лаб. иммунобиотехнологии

goldovskaya00@mail.ruhttps://orcid.org/0009-0008-6272-0368VavilovaIrina V.ВавиловаИрина Викторовна
Russian Federation

junior researcher, Laboratory of immunobiotechnology

м. н. с. лаб. иммунобиотехнологии

vavilovairinav@yandex.ruhttps://orcid.org/0009-0009-5964-6045ChugunovaAnastasia S.ЧугуноваАнастасия Сергеевна
Russian Federation

laboratory assistant researcher, Laboratory of immunobiotechnology

лаборант-исследователь лаб. иммунобиотехнологии

170297_97@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0003-2548-6142DolzhikovaInna V.ДолжиковаИнна Вадимовна
Russian Federation

Cand. Sci. (Biol.), Head, Laboratory of the State Virus Collection

канд. биол. наук, зав. лаб. государственной коллекции вирусов

dolzhikova@gamaleya.orghttps://orcid.org/0000-0002-8518-1669ShcherbininDmitry N.ЩербининДмитрий Николаевич
Russian Federation

Cand. Sci. (Biol.), Laboratory of molecular biotechnology

канд. биол. наук лаб. молекулярной биотехнологии

dim284@inbox.ruhttps://orcid.org/0000-0002-1289-3411ShcheblyakovDmitry V.ЩебляковДмитрий Викторович
Russian Federation

Cand. Sci. (Biol.), leading researcher, Head, Laboratory of immunobiotechnology

канд. биол. наук, в. н. с., зав. лаб. иммунобиотехнологии

sdmitriyv@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0003-4035-6581LogunovDenis Y.ЛогуновДенис Юрьевич
Russian Federation

Dr. Sci. (Biol.), RAS academician, Head, Laboratory of cellular microbiology

д-р биол. наук, академик РАН, зав. лаб. клеточной микробиологии

logunov@gamaleya.orghttps://orcid.org/0000-0003-1769-5059GintsburgAlexander L.ГинцбургАлександр Леонидович
Russian Federation

Dr. Sci. (Biol.), RAS Academician, Director

д-р биол. наук, академик РАН, директор

gintsburg@gamaleya.orgNational Research Center of Epidemiology and Microbiology named after Honorary Academician N.F. GamaleyaНациональный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи300320251021183001022025Copyright ©; 2025, Zrelkin D.I., Zubkova O.V., Ozharovskaia T.A., Popova O., Voronina D.V., Goldovskaya P.P., Vavilova I.V., Chugunova A.S., Dolzhikova I.V., Shcherbinin D.N., Shcheblyakov D.V., Logunov D.Y., Gintsburg A.L.Copyright ©; 2025, Зрелкин Д.И., Зубкова О.В., Ожаровская Т.А., Попова О., Воронина Д.В., Голдовская П.П., Вавилова И.В., Чугунова А.С., Должикова И.В., Щербинин Д.Н., Щебляков Д.В., Логунов Д.Ю., Гинцбург А.Л.2025Zrelkin D.I., Zubkova O.V., Ozharovskaia T.A., Popova O., Voronina D.V., Goldovskaya P.P., Vavilova I.V., Chugunova A.S., Dolzhikova I.V., Shcherbinin D.N., Shcheblyakov D.V., Logunov D.Y., Gintsburg A.L.Зрелкин Д.И., Зубкова О.В., Ожаровская Т.А., Попова О., Воронина Д.В., Голдовская П.П., Вавилова И.В., Чугунова А.С., Должикова И.В., Щербинин Д.Н., Щебляков Д.В., Логунов Д.Ю., Гинцбург А.Л.https://creativecommons.org/licenses/by/4.0https://microbiol.crie.ru/jour/article/view/18755

Introduction. In 2022, the World Health Organization declared monkeypox a public health emergency. The monkeypox virus (MPV) is part of the Orthopoxvirus genus within the Poxviridae family. During replication, orthopoxviruses produce two distinct forms of viral particles: the extracellular enveloped virion (EEV), released via exocytosis, and the intracellular mature virion (IMV), released through cell lysis. These forms differ in surface proteins composition, influencing their immunogenicity and infectivity.

Aim. To evaluate the immunogenic and protective activity of nine surface antigens of vaccinia virus.

Materials and methods . Recombinant human adenoviruses type 2 (rAd2) carrying surface antigens of vaccinia virus were obtained using homologous recombination in bacteria, followed by adenoviral particle assembly in HEK293 cells. The immunogenic and protective properties of these adenoviruses were tested in BALB/c mice. The presence of antibodies to the vaccinia virus was assessed using ELISA, and survival rates were evaluated in a lethal infection model after intranasal challenge with the vaccinia virus strain Western Reserve.

Results. The most immunogenic and protective antigens of the vaccinia virus within rAd2 were glycoprotein B5 of the EEV and membrane-associated protein H3 of the IMV, both showing 100% protective efficacy after intranasal immunization.

Conclusion. Using a panel of recombinant adenoviruses carrying genes of vaccinia virus surface proteins, it was shown that optimal protection is achieved using a combination of enveloped and mature virion antigens. This method could be used for development of new multivalent preparations against various viral infections.

Введение. Всемирная организация здравоохранения в 2022 г. объявила оспу обезьян чрезвычайной ситуацией в области здравоохранения. Вирус оспы обезьян (MPV) принадлежит к роду Orthopoxvirus семейства Poxviridae. Ортопоксвирусы во время репликации образуют 2 отдельные формы вирусных частиц: экзоцитозом выделяется оболочечный внеклеточный вирион (EEV), а зрелый внутриклеточный вирион (IMV) высвобождается в результате лизиса клеток. У этих двух форм вирионов отличаются наборы поверхностных белков, что обусловливает их различия в иммуногенности и инфекционности.

Цель работы — оценка иммуногенной и протективной активности 9 поверхностных антигенов вируса осповакцины.

Материал и методы. Геномы рекомбинантных аденовирусов человека 2-го серотипа, несущих поверхностные антигены вируса осповакцины, получали методом гомологичной рекомбинации в бактериальных клетках с последующей сборкой аденовирусных частиц в клетках НЕК293. Иммуногенные и протективные свойства полученных рекомбинантных аденовирусов изучали на мышах BALB/c. Сыворотки крови после иммунизации животных исследовали методом иммуноферментного анализа на наличие антител к вирусу осповакцины. Протективные свойства оценивали на летальной модели инфекции мышей после интраназального заражения вирусом осповакцины штамма Western Reserve.

Результаты. Наиболее иммуногенными и протективными антигенами вируса осповакцины в составе рекомбинантных аденовирусов человека 2-го серотипа были гликопротеин В5 оболочечного внеклеточного вириона и мембранно-ассоциированный белок Н3 зрелого внутриклеточного вириона. При изучении защитной эффективности антигенов показана 100% эффективность В5 и Н3 при интраназальной иммунизации.

Заключение. При использовании панели рекомбинантных аденовирусных векторов, несущих гены поверхностных белков вируса осповакцины, показано, что оптимальная защита может быть достигнута с помощью комбинации антигенов оболочечного и зрелого вирионов. Данный подход может быть использован при разработке новых поливалентных вакцин против различных вирусных инфекций.

monkeypox virusvaccinia virusrecombinant adenovirusimmunogenicityprotective activityвирус оспы обезьянвирус осповакцинырекомбинантный аденовирусиммуногенностьпротективностьEmerson G.L., Li Y., Frace M.A., et al. The phylogenetics and ecology of the orthopoxviruses endemic to North America. PLoS One. 2009;4(10):e7666. DOI: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0007666McInnes C.J., Wood A.R., Thomas K., et al. Genomic characterization of a novel poxvirus contributing to the decline of the red squirrel (Sciurus vulgaris) in the UK. J. Gen. Virol. 2006;87(Pt. 8):2115–25. DOI: https://doi.org/10.1099/vir.0.81966-0Smits J.E., Tella J.L., Carrete M., et al. An epizootic of avian pox in endemic short-toed larks (Calandrella rufescens) and Berthelot’s pipits (Anthus berthelotti) in the Canary Islands, Spain. Vet. Pathol. 2005;42:59–65. DOI: https://doi.org/10.1354/vp.42-1-59Thiel T., Whiteman N.K., Tirapé A., et al. Characterization of canarypox-like viruses infecting endemic birds in the Galápagos islands. J. Wildl. Dis. 2005;41(2):342–53. DOI: https://doi.org/10.7589/0090-3558-41.2.342Voigt E.A., Kennedy R.B., Poland G.A. Defending against smallpox: a focus on vaccines. Expert Rev. Vaccines. 2016;15(9):1197–211. DOI: https://doi.org/10.1080/14760584.2016.1175305Henderson D.A. The eradication of smallpox – an overview of the past, present, and future. Vaccine. 2011;29(Suppl. 4):D7–9. DOI: https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2011.06.080Nuzzo J.B., Borio L.L., Gostin L.O. The WHO declaration of monkeypox as a global public health emergency. JAMA. 2022; 328(7): 615–7. DOI: https://doi.org/10.1001/jama.2022.12513WHO. Executive board, 154th session. Provisional agenda item 18 "Smallpox eradication: destruction of variola virus stocks"; 2024.Rothenburg S., Yang Z., Beard P., et al. Monkeypox emergency: Urgent questions and perspectives. Cell. 2022;185(18):3279–81. DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.08.002Zhang R.R., Wang Z.J., Zhu Y.L., et al. Rational development of multicomponent mRNA vaccine candidates against mpox. Emerg. Microbes Infect. 2023;12(1):2192815. DOI: https://doi.org/10.1080/22221751.2023.2192815Galinski M.S. Paramyxoviridae: transcription and replication. Adv. Virus Res. 1991;39:129–62. DOI: https://doi.org/10.1016/S0065-3527(08)60794-0Curran J., Kolakofsky D. Replication of paramyxoviruses. Adv. Virus Res. 1999;54:403–22. DOI: https://doi.org/10.1016/S0065-3527(08)60373-5Law M., Smith G.L. Antibody neutralization of the extracellular enveloped form of vaccinia virus. Virology. 2001;280(1):132–42. DOI: https://doi.org/10.1006/viro.2000.0750Riccardo V., Pablo G.C. Neutralization determinants on poxviruses. Viruses. 2023;15(12):2396. DOI: https://doi.org/10.3390/v15122396Moss B. Smallpox vaccines: targets of protective immunity. Immunol. Rev. 2011;239(1):8–26. DOI: https://doi.org/10.1111/j.1600-065X.2010.00975.xLustig S., Fogg C., Whitbeck J.C., et al. Combinations of polyclonal or monoclonal antibodies to proteins of the outer membranes of the two infectious forms of vaccinia virus protect mice against a lethal respiratory challenge. J. Virol. 2005;79(21):13454–62. DOI: https://doi.org/10.1128/JVI.79.21.13454-13462.2005Mucker E.M., Golden J.W., Hammerbeck C.D., et al. A nucleic acid-based orthopoxvirus vaccine targeting the vaccinia virus L1, A27, B5, and A33 proteins protects rabbits against lethal rabbitpox virus aerosol challenge. J. Virol. 2022;96(3):e0150421. DOI: https://doi.org/10.1128/JVI.01504-21Gilchuk I., Gilchuk P., Sapparapu G., et al. Cross-neutralizing and protective human antibody specificities to poxvirus infections. Cell. 2016;167(3):684–94.e9. DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2016.09.049Sakhatskyy P., Wang S., Chou T.W., Lu S. Immunogenicity and protection efficacy of monovalent and polyvalent poxvirus vaccines that include the D8 antigen. Virology. 2006;355(2):164–74. DOI: https://doi.org/10.1016/j.virol.2006.07.017.Niles E.G., Seto J. Vaccinia virus gene D8 encodes a virion transmembrane protein. J. Virol. 1988;62(10):3772–8. DOI: https://doi.org/10.1128/jvi.62.10.3772-3778.1988Takahashi T., Oie M., Ichihashi Y. N-terminal amino acid sequences of vaccinia virus structural proteins. Virology. 1994;202(2): 844–52. DOI: https://doi.org/10.1006/viro.1994.1406Chertov O.Yu., Telezhinskaya I.N., Zaitseva E.V., et al. Amino acid sequence determination of vaccinia virus immunodominant protein p35 and identification of the gene. Biomed. Sci. 1991;2(2):151–4.Franke C.A., Wilson E.M., Hruby D.E. Use of a cell-free system to identify the vaccinia virus L1R gene product as the major late myristylated virion protein M25. J. Virol. 1990;64(12):5988–96. DOI: https://doi.org/10.1128/jvi.64.12.5988-5996.1990Hooper J., Custer D., Thompson E. Four-gene-combination DNA vaccine protects mice against a lethal vaccinia virus challenge and elicits appropriate antibody responses in nonhuman primates. Virology. 2003;306(1):181–95. DOI: https://doi.org/10.1016/S0042-6822(02)00038-7Golden J.W., Zaitseva M., Kapnick S., et al. Polyclonal antibody cocktails generated using DNA vaccine technology protect in murine models of orthopoxvirus disease. Virol. J. 2011;8:441. DOI: https://doi.org/10.1186/1743-422X-8-441Berhanu A., Wilson R.L., Kirkwood-Watts D.L., et al. Vaccination of BALB/c mice with Escherichia coli-expressed vaccinia virus proteins A27L, B5R, and D8L protects mice from lethal vaccinia virus challenge. J. Virol. 2008;82(7):3517–29. DOI: https://doi.org/10.1128/JVI.01854-07Fogg C., Lustig S., Whitbeck J.C., et al. Protective immunity to vaccinia virus induced by vaccination with multiple recombinant outer membrane proteins of intracellular and extracellular virions. J. Virol. 2004;78(19):10230–7. DOI: https://doi.org/10.1128/JVI.78.19.10230-10237.2004Logunov D.Y., Dolzhikova I.V., Zubkova O.V., et al. Safety and immunogenicity of an rAd26 and rAd5 vector-based heterologous prime-boost COVID-19 vaccine in two formulations: two open, non-randomised phase 1/2 studies from Russia. Lancet. 2020;396(10255):887–97. DOI: https://doi.org/10.1016/S0140-6736(20)31866-3Dolzhikova I.V., Zubkova O.V., Tukhvatulin A.I., et al. Safety and immunogenicity of GamEvac-Combi, a heterologous VSV- and Ad5-vectored Ebola vaccine: An open phase I/II trial in healthy adults in Russia. Hum. Vaccin. Immunother. 2017;13(3):613–20. DOI: https://doi.org/10.1080/21645515.2016.1238535Tukhvatulin A.I., Dolzhikova I.V., Shcheblyakov D.V., et al. An open, non-randomised, phase 1/2 trial on the safety, tolerability, and immunogenicity of single-dose vaccine «Sputnik Light» for prevention of coronavirus infection in healthy adults. Lancet Reg. Health Eur. 2021;11:100241. DOI: https://doi.org/10.1016/j.lanepe.2021.100241Yakimovich A., Mercer J. High-content analyses of vaccinia plaque formation. In: Mercer J., eds. Vaccinia Virus. Methods in Molecular Biology, Volume 2023. New York;2019:237–53. DOI: https://doi.org/10.1007/978-1-4939-9593-6_15Ожаровская Т.А., Попова О., Зубкова О.В. и др. Разработка и характеристика векторной системы на основе аденовируса обезьян 25-го серотипа. Вестник РГМУ. 2023;(1):4–11. DOI: https://doi.org/10.24075/vrgmu.2023.006 Ozharovskaia T.A., Popova O., Zubkova O.V., et al. Development and characterization of a vector system based on the simian adenovirus type 25. Bulletin of RSMU. 2023;(1):4–11. DOI: https://doi.org/10.24075/brsmu.2023.006Su Q., Sena-Esteves M., Gao G. Purification of the recombinant adenovirus by cesium chloride gradient centrifugation. Cold Spring Harb. Protoc. 2019;2019(5). DOI: https://doi.org/10.1101/pdb.prot095547Maizel J.V., White D.O., Scharff M.D. The polypeptides of adenovirus: I. Evidence for multiple protein components in the virion and a comparison of types 2, 7A, and 12. Virology. 1968;36(1):115–25. DOI: https://doi.org/10.1016/0042-6822(68)90121-9Shchelkunov S.N., Totmenin A.V., Safronov P.F., et al. Analysis of the monkeypox virus genome. Virology. 2002;297(2):172–94. DOI: https://doi.org/10.1006/viro.2002.1446Antoine G., Scheiflinger F., Dorner F., Falkner F.G. The complete genomic sequence of the modified vaccinia Ankara strain: comparison with other orthopoxviruses. Virology. 1998;244(2): 365–96. DOI: https://doi.org/10.1006/viro.1998.9123Diaz-Cánova D., Mavian C., Brinkmann A., et al. Genomic sequencing and phylogenomics of cowpox virus. Viruses. 2022;14(10):2134. DOI: https://doi.org/10.3390/v14102134Zrelkin D.I., Goldovskaia P.P., Kan V.Y. Determination of threshold value of protective level of antibodies to one of members of orthopoxvirus genus. In: Scientific Research of the SCO Countries: Synergy and Integration. Beijing;2024. DOI: https://doi.org/10.34660/INF.2024.87.21.085Максютов Р.A., Якубицкий С.Н., Колосова И.В., Щелкунов С.Н. Сравнение кандидатных вакцин нового поколения против ортопоксвирусных инфекций человека. Acta Naturae. 2017;9(2):93–99. Maksyutov R.A., Yakubitskyi S.N., Kolosova I.V., Shchelkunov S.N. Comparing new-generation candidate vaccines against human orthopoxvirus infections. Acta Naturae. 2017;9(2):88–93. DOI: https://doi.org/10.32607/20758251-2017-9-2-88-93 EDN: https://elibrary.ru/yyylklСтовба Л.Ф., Чухраля О.В., Черникова Н.К. и др. Безопасность и иммуногенность вакцины третьего поколения IMVAMUNE® на основе вируса вакцины, штамм MVA. БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2023;23(1):26–41. Stovba L.F., Chukhralya O.V., Chernikova N.K., et al. Safety and immunogenicity of IMVAMUNE®, a third-generation vaccine based on the modified vaccinia Ankara (MVA) strain. Biological Products. Prevention, Diagnosis, Treatment. 2023;23(1):26–41. DOI: https://doi.org/10.30895/2221-996X-2023-23-1-26-41 EDN: https://elibrary.ru/tjwrhxЩелкунов С.Н., Сергеев А.А., Титова К.А. и др. Увеличение протективности противооспенной вакцины. Медицинская иммунология. 2022;24(1):201–6. Shchelkunov S.N., Sergeev A.A., Titova K.A., et al. Increasing protectivity of the smallpox vaccine. Medical Immunology (Russia). 2022;24(1):201–6. DOI: https://doi.org/10.15789/1563-0625-IPO-2203 EDN: https://elibrary.ru/asgrmiЩелкунов С.Н., Якубицкий С.Н., Титова К.А. и др. Аттенуированный и высокоиммуногенный вариант вируса осповакцины. Acta Naturae. 2024;16(2):82–9. Shchelkunov S.N., Yakubitskiy S.N., Titova K.A., et al. An attenuated and highly immunogenic variant of the vaccinia virus. Acta Naturae. 2024;16(2):82–9. DOI: https://doi.org/10.32607/actanaturae.27384 EDN: https://elibrary.ru/kcsbnpPayne L.G., Kristensson K. Extracellular release of enveloped vaccinia virus from mouse nasal epithelial cells in vivo. J. Gen. Virol. 1985;66(Pt. 3):643–6. DOI: https://doi.org/10.1099/0022-1317-66-3-643Kenner J., Cameron F., Empig C., et al. LC16m8: аn attenuated smallpox vaccine. Vaccine. 2006;24(47-48):7009–22. DOI: https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2006.03.087Gao J., Mese K., Bunz O., Ehrhardt A. State‐of‐the‐art human adenovirus vectorology for therapeutic approaches. FEBS Lett. 2019;593(24):3609–22. DOI: https://doi.org/10.1002/1873-3468.13691Hervouet C., Luci C., Bekri S., et al. Antigen-bearing dendritic cells from the sublingual mucosa recirculate to distant systemic lymphoid organs to prime mucosal CD8 T cells. Mucosal Immunol. 2014;7(2):280–91. DOI: https://doi.org/10.1038/mi.2013.45Holmgren J., Czerkinsky C. Mucosal immunity and vaccines. Nat. Med. 2005;11(4 Suppl.):S45–53. DOI: https://doi.org/10.1038/nm1213Wang Y., Yang K., Zhou H. Immunogenic proteins and potential delivery platforms for mpox virus vaccine development: а rapid review. Int. J. Biol. Macromol. 2023;245:125515. DOI: https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2023.125515Kaufman D.R., Goudsmit J., Holterman L., et al. Differential antigen requirements for protection against systemic and intranasal vaccinia virus challenges in mice. J. Virol. 2008;82(14):6829–37. DOI: https://doi.org/10.1128/JVI.00353-08Agrawal S., Gupta S., Agrawal A. Vaccinia virus proteins activate human dendritic cells to induce T cell responses in vitro. Vaccine. 2009;27(1):88–92. DOI: https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2008.10.031Monath T.P., Caldwell J.R., Mundt W., et al. ACAM2000 clonal Vero cell culture vaccinia virus (New York City Board of Health strain) — a second-generation smallpox vaccine for biological defense. Int. J. Infect. Dis. 2004;8(Suppl. 2):S31–44. DOI: https://doi.org/10.1016/j.ijid.2004.09.002