Journal of microbiology, epidemiology and immunobiologyJournal of microbiology, epidemiology and immunobiologyЖурнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии0372-93112686-7613Central Research Institute for Epidemiology1855510.36233/0372-9311-419wjphcnORIGINAL RESEARCHESОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯResearch ArticleMultilocus sequence-typing scheme for Borrelia miyamotoi — the erythema-free ixodid tick-borne borreliosis pathogensСхема мультилокусного секвенирования-типирования для характеристики Borrelia miyamotoi — возбудителей безэритемной формы иксодового клещевого боррелиозаhttps://orcid.org/0000-0001-8207-9215MironovKonstantin O.МироновКонстантин Олегович
Russian Federation

D. Sci. (Med.), Head, Laboratory of molecular methods for genetic polymorphisms research, Central Research Institute for Epidemiology

д.м.н., зав. лаб. молекулярных методов изучения генетических полиморфизмов Центрального научно-исследовательского института эпидемиологии Роспотребнадзора

mironov@pcr.ruhttps://orcid.org/0000-0001-7548-9267TitkovAnton V.ТитковАнтон Владимирович
Russian Federation

researcher, Laboratory of zoonoses, Central Research Institute for Epidemiology

н.с. лаб. эпидемиологии природно-очаговых инфекций Центрального научно-исследовательского института эпидемиологии Роспотребнадзора

mironov@pcr.ruhttps://orcid.org/0000-0002-5238-7900KuleshovKonstantin V.КулешовКонстантин Валерьевич
Russian Federation

Cand. Sci. (Biol.), Head, Laboratory of molecular diagnostics and epidemiology of intestinal infections, Central Research Institute for Epidemiology

к.б.н., зав. лаб. молекулярной диагностики и эпидемиологии кишечных инфекций Центрального научно-исследовательского института эпидемиологии Роспотребнадзора

mironov@pcr.ruhttps://orcid.org/0000-0001-7450-0081PlatonovAlexander E.ПлатоновАлександр Евгеньевич
Russian Federation

D. Sci. (Biol.), Prof., chief researcher, Laboratory of zoonoses, Central Research Institute for Epidemiology

д.б.н., проф., г.н.с. лаб. эпидемиологии природно-очаговых инфекций Центрального научно-исследовательского института эпидемиологии Роспотребнадзора

mironov@pcr.ruCentral Research Institute for EpidemiologyЦентральный научно-исследовательский институт эпидемиологии Роспотребнадзора13032024101180880803202408032024Copyright ©; 2024, Mironov K.O., Titkov A.V., Kuleshov K.V., Platonov A.E.Copyright ©; 2024, Миронов К.О., Титков А.В., Кулешов К.В., Платонов А.Е.2024Mironov K.O., Titkov A.V., Kuleshov K.V., Platonov A.E.Миронов К.О., Титков А.В., Кулешов К.В., Платонов А.Е.https://creativecommons.org/licenses/by/4.0https://microbiol.crie.ru/jour/article/view/18555

Introduction. Borrelia miyamotoi is a pathogen of erythema-free ixodid tick-borne borreliosis (ITBB), a disease widespread in Russia. To date, there are no generally accepted methods for B. miyamotoi genotyping. The multilocus sequencing typing (MLST) scheme of Borrelia was originally developed for B. burgdorferi, and does not have the required discrimination power for monitoring the ITBB pathogens.

The objective of this study is to develop the MLST scheme for B. miyamotoi.

Materials and Methods. The whole genome sequences of 10 reference strains (GenBank) were analyzed for the selection of the house-keeping loci. The MLST scheme development was based on principles published by the authors of the method. For this experiment, 81 B. miyamotoi strains and positive clinical samples were used to test the MLST scheme.

Results. After analyzing the genomic data, 8 house-keeping loci were chosen for MLST, for which the PCR and sequencing primers were designed. Each MLST loci was represented by several alleles (from 4 to 7) which form 15 sequence types. The genetic diversity of pathogens isolated from ITBB patients and ticks were characterized.

Discussion. Based on pairwise distances between allelic profiles, the sequence types can be classified into four groups. The first two groups are clonal complexes; the other two groups are formed by once identified sequence types. The first clonal complex unites 11 sequence types (80 or 88% of the characterized B. miyamotoi), the second consists of 2 sequence types (9 or 9.8%). The genetic differences between B. miyamotoi are associated with the sources of strains and biological isolates. The MLST based classification confirms the previously described genetic heterogeneity of B. miyamotoi populations associated with ecologically unrelated vectors of ITBB pathogens.

Conclusion. The proposed MLST scheme is an appropriate tool for ITBB pathogen classification and evolutionary change characterization within clonal complexes.

Введение. Borrelia miyamotoi — возбудитель безэритемной формы иксодового клещевого боррелиоза (ИКБ-БМ) — широко распространённого в России заболевания. В настоящее время не существует общепринятых методик для внутривидовой характеристики B. miyamotoi. Схема мультилокусного секвенирования-типирования (МЛСТ) боррелий изначально была разработана для B. burgdorferi и не обладает необходимой дискриминирующей способностью для мониторинга возбудителей ИКБ-БМ.

Цель работы — разработка и апробация схемы МЛСТ B. miyamotoi.

Материалы и методы. Выбор фрагментов для МЛСТ основан на полногеномных последовательностях 10 референсных штаммов (GenBank). Схему МЛСТ разработали в соответствии с принципами, опубликованными авторами метода. Для апробации схемы МЛСТ использовали 81 биологический образец, содержащий ДНК B. miyamotoi.

Результаты. После анализа геномных данных выбрали 8 фрагментов генов, для которых провели дизайн праймеров для ПЦР и секвенирования. Фрагменты генов представлены несколькими аллелями (от 4 до 7), которые образуют 15 сиквенс-типов, на основании анализа которых охарактеризовали генетическое разнообразие возбудителей, выделенных от больных ИКБ-БМ и от переносчиков.

Обсуждение. На основании количества несовпадений в аллельных профилях сиквенс-типы могут быть классифицированы на 4 группы. Первым двум соответствуют клональные комплексы, две другие образованы однократно выявленными сиквенс-типами. Первый клональный комплекс (I) объединяет 11 сиквенс-типов (80 или 88% охарактеризованных B. miyamotoi), второй (II) — 2 сиквенс-типа (9 или 9,8%). Выраженные генетические отличия B. miyamotoi связаны с источниками штаммов и биологических образцов. Предложенная на основании МЛСТ классификация подтверждает продемонстрированную ранее генетическую гетерогенность популяций B. miyamotoi, обусловленную экологически не связанными переносчиками возбудителей ИКБ-БМ.

Заключение. Предложенная схема МЛСТ является удобным инструментом для мониторинга возбудителей ИКБ-БМ, выделенных из разных источников, и для характеристики эволюционных изменений в определённых клональных комплексах.

Ixodes tick-borne borreliosisBorrelia miyamotoiclonal complexmultilocus sequence typingsequence typeBorrelia miyamotoiиксодовые клещевые боррелиозыклональный комплексмультилокусное секвенирование-типированиесиквенс-типРоссийский научный фондThe Russian Science Foundation15-15-00072ППравительство Российской ФедерацииGovernment of Russian FederationAAAA-A21-121011890133-8Платонов А.Е. «Новая» инфекция, вызываемая Borrelia miyamotoi: микробиология, эпидемиология, диагностика, клиника и патогенез. М.;2017. Platonov A.E. A «New» Infection Caused by Borrelia miyamotoi: Microbiology, Epidemiology, Diagnostics, Clinic and Pathogenesis. Moscow;2017. EDN: https://elibrary.ru/yabrqrМиронов К.О., Титков А.В., Кулешов К.В. и др. Разработка и практическое применение методики для идентификации поверхностных антигенов Borrelia miyamotoi. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2021;98(3):339–50. Mironov K.O., Titkov A.V., Kuleshov K.V., et al. Development and application of the technique for identification of Borrelia miyamotoi surface antigens. Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology. 2021;98(3):339–50. DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-142 EDN: https://elibrary.ru/kmeswhМиронов К.О., Титков А.В., Платонов А.Е. Комплекс молекулярно-биологических методик для внутривидовой характеристики бактерий вида Borrelia miyamotoi. Национальные приоритеты России. 2021;42(3):208–11. Mironov K.O., Titkov A.V., Platonov A.E. Complex of molecular biological techniques for Borrelia miyamotoi typing. National Priorities of Russia. 2021;42(3):208–11. EDN: https://elibrary.ru/kmeswhФоменко Н.В., Боргояков В.Ю., Панов В.В. Генетические особенности ДНК боррелий вида Borrelia miyamotoi, выявляемых в таежных клещах. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2011;(2):12–7. Fomenko N.V., Borgoyakov V.Yu., Panov V.V. Genetic features of DNA of Borrelia miyamotoi transmitted by Ixodes persulcatus. Molecular Genetics, Microbiology and Virology. 2011;(2):12–7. EDN: https://elibrary.ru/nwewlrMaiden M.C., Bygraves J.A., Feil E., et al. Multilocus sequence typing: a portable approach to the identification of clones within populations of pathogenic microorganisms. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1998;95(6):3140–5. DOI: https://doi.org/10.1073/pnas.95.6.3140Платонов А.Е., Шипулин Г.А., Платонова О.В. Мультилокусное секвенирование – новый метод генотипирования бактерий и первые результаты его применения. Генетика. 2000;36(5):597–605. Platonov A.E., Shipulin G.A., Platonova O.V. Multilocus sequence typing: a new method and the first results in the genotyping of bacteria. Genetika. 2000;36(5):597–605. EDN: https://elibrary.ru/mpfxxbJolley K.A., Bray J.E., Maiden M.C.J. Open-access bacterial population genomics: BIGSdb software, the PubMLST.org website and their applications. Wellcome Open Res. 2018;3:124. DOI: https://doi.org/10.12688/wellcomeopenres.14826.1Margos G., Gatewood A.G., Aanensen D.M., et al. MLST of housekeeping genes captures geographic population structure and suggests a European origin of Borrelia burgdorferi. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2008;105(25):8730–5. DOI: https://doi.org/10.1073/pnas.0800323105Kuleshov K.V., Koetsveld J., Goptar I.A., et al. Whole-genome sequencing of six Borrelia miyamotoi clinical strains isolated in Russia. Genome Announc. 2018;6(1):e01424-17. DOI: https://doi.org/10.1128/genomeA.01424-17Fukunaga M., Takahashi Y., Tsuruta Y., et al. Genetic and phenotypic analysis of Borrelia miyamotoi sp. nov., isolated from the ixodid tick Ixodes persulcatus, the vector for Lyme disease in Japan. Int. J. Syst. Bacteriol. 1995;45(4):804–10. DOI: https://doi.org/10.1099/00207713-45-4-804Kingry L.C., Replogle A., Dolan M., et al. Chromosome and large linear plasmid sequences of a Borrelia miyamotoi strain isolated from Ixodes pacificus ticks from California. Genome Announc. 2017;5(37):e00960-17. DOI: https://doi.org/10.1128/genomeA.00960-17Миронов К.О., Платонов А.Е., Королева И.С., Шипулин Г.А. Анализ московской популяции штаммов Neisseria meningitidis методом мультилокусного секвенирования-типирования. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2006;93(2):31–6. Mironov K.O., Platonov A.E., Koroleva I.S., Shipulin G.A. Analysis of the Moscow population of Neisseria meningitidis strains by the method of multilocus sequencing-typing. Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology. 2006;93(2):31–6. EDN: https://elibrary.ru/htqatxJolley K.A., Feil E.J., Chan M.S., Maiden M.C. Sequence type analysis and recombinational tests (START). Bioinformatics. 2001;17(12):1230–1. DOI: https://doi.org/10.1093/bioinformatics/17.12.1230Platonov A.E., Karan L.S., Kolyasnikova N.M., et al. Humans infected with relapsing fever spirochete Borrelia miyamotoi, Russia. Emerg. Infect. Dis. 2011;17(10):1816–23. DOI: https://doi.org/10.3201/eid1710.101474 EDN: https://elibrary.ru/pbdedxCrowder C.D., Carolan H.E., Rounds M.A., et al. Prevalence of Borrelia miyamotoi in Ixodes ticks in Europe and the United States. Emerg. Infect. Dis. 2014;20(10):1678–82. DOI: https://doi.org/10.3201/eid2010.131583