Journal of microbiology, epidemiology and immunobiologyJournal of microbiology, epidemiology and immunobiologyЖурнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии0372-93112686-7613Central Research Institute for Epidemiology1852010.36233/0372-9311-487kjnhygORIGINAL RESEARCHESОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯResearch ArticleDevelopment of a technique for molecular typing of Bacillus anthracis strains using new VNTR and INDEL markersРазработка методики молекулярного типирования штаммов Bacillus anthracis с использованием новых VNTR- и INDEL-маркеровhttps://orcid.org/0000-0001-7033-997257223328514Q-7273-20168878-3299PechkovskiiGrigorii A.ПечковскийГригорий Александрович
Russian Federation

junior researcher, Anthrax laboratory

м.н.с., лаб. сибирской язвы

grigorii.pechkovskii@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0002-8163-1300EremenkoEvgeny I.ЕременкоЕвгений Иванович
Russian Federation

D. Sci. (Med.), Professor, principal researcher, Anthrax laboratory

д.м.н., проф., г.н.с., лаб. сибирской язвы

grigorii.pechkovskii@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0002-5196-784XRyazanovaAlla G.РязановаАлла Геннадьевна
Russian Federation

Cand. Sci. (Med.), Head, Anthrax laboratory

к.м.н., зав. лаб. сибирской язвы

grigorii.pechkovskii@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0001-6458-6790PisarenkoSergey V.ПисаренкоСергей Владимирович
Russian Federation

Cand. Sci. (Chem.), leading researcher, Laboratory of biochemistry

к.х.н., в.н.с., лаб. биохимии

grigorii.pechkovskii@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0001-9152-4026ShapakovNikolay A.ШапаковНиколай Андреевич
Russian Federation

junior researcher, Laboratory of biochemistry

м.н.с., лаб. биохимии

grigorii.pechkovskii@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0002-7744-3112AksenovaLyudmila Yu.АксеноваЛюдмила Юрьевна
Russian Federation

Cand. Sci. (Med.), senior researcher, Anthrax laboratory

к.м.н., с.н.с., лаб. сибирской язвы

grigorii.pechkovskii@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0003-0274-898XSemenovaOlga V.СеменоваОльга Викторовна
Russian Federation

Cand. Sci. (Biol.), researcher, Anthrax laboratory

к.б.н., н.с., лаб. сибирской язвы

grigorii.pechkovskii@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0003-2011-880XTimchenkoLyudmila D.ТимченкоЛюдмила Дмитриевна
Russian Federation

D. Sci. (Vet.), Professor, principal researcher, Interdepartmental scientific and educational laboratory of experimental immunomorphology, immunopathology and immunobiotechnology

д.вет.н., проф., г.н.с. межкафедральной научно-образовательной лаборатории экспериментальной иммуноморфологии, иммунопатологии и иммунобиотехнологии

grigorii.pechkovskii@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0002-9362-3949KulichenkoAlexander N.КуличенкоАлександр Николаевич
Russian Federation

D. Sci. (Med.), Professor, Academician of RAS, Director

д.м.н., проф., академик РАН, директор

grigorii.pechkovskii@gmail.comStavropol Plague Control Research InstituteСтавропольский противочумный институт РоспотребнадзораNorth-Caucasus Federal UniversityСеверо-Кавказский федеральный университет1607202410133623711201202401072024Copyright ©; 2024, Pechkovskii G.A., Eremenko E.I., Ryazanova A.G., Pisarenko S.V., Shapakov N.A., Aksenova L.Y., Semenova O.V., Timchenko L.D., Kulichenko A.N.Copyright ©; 2024, Печковский Г.А., Еременко Е.И., Рязанова А.Г., Писаренко С.В., Шапаков Н.А., Аксенова Л.Ю., Семенова О.В., Тимченко Л.Д., Куличенко А.Н.2024Pechkovskii G.A., Eremenko E.I., Ryazanova A.G., Pisarenko S.V., Shapakov N.A., Aksenova L.Y., Semenova O.V., Timchenko L.D., Kulichenko A.N.Печковский Г.А., Еременко Е.И., Рязанова А.Г., Писаренко С.В., Шапаков Н.А., Аксенова Л.Ю., Семенова О.В., Тимченко Л.Д., Куличенко А.Н.https://creativecommons.org/licenses/by/4.0https://microbiol.crie.ru/jour/article/view/18520

Introduction. Bacillus anthracis, the pathogen of a particularly dangerous zoonotic disease known as anthrax, requires strict epidemiological control and is characterized by high genetic homogeneity, which necessitates the development of genotyping methods.

The aim of the study were to to find and characterize the VNTR and INDEL loci of B. anthracis and to develop on their basis a genotyping technique by PCR with electrophoretic detection of the results.

Materials and methods. Marker search and phylogenetic analysis were performed on a sample of 388 genomes of B. anthracis strains, 322 from the GenBank collection (RefSeq) and 66 from the collection of the Stavropol Anti-Plague Institute of Rospotrebnadzor. Phylogenetic analysis was performed on the basis of SNP crustal alignment using the Parsnp program. The search for markers was carried out using the Mauve program and author's scripts in Python. PCR was performed using a ScreenMix-HS kit (CJSC "Eurogen", Russia).

Results. Genomic variations of B. anthracis strains (SNP — 25,664, SNR — 14,387, VNTR — 693, INDEL — 14,667) were found, bioinformatic analysis of which revealed nine new VNTR and six INDEL molecular markers most suitable for genotyping. The genetic (allelic) variants of the markers are described. Primers were selected for the found markers and a PCR protocol with detection by electrophoresis in agarose gel was developed. When typing using VNTR markers was applied, the strains were divided into nine clusters: A.Br.Ames, A.Br.001/002, A.Br.Aust94, A.Br.005/006, A.Br.008/009 (Tsiankovskii), A.Br.008/009 (STI), A.Br.008/009 (A.Br.125), A.Br.008/009 (strain 228/269), B.Br.001/002. When typing using INDEL markers, the strains were divided into six clusters: A.Br.Ames, A.Br.001/002, A.Br.Aust94, A.Br.008/009(Tsiankovskii), B.Br.001/002(B.Br.014), as well as a cluster comprising several genetic lineages: A.Br.008/009 (STI), A.Br.008/009 (A.Br.125), A.Br.005/006 и B.Br.001/002.

Conclusion. The use of the developed methodology for the identification of variable VNTR and INDEL loci makes it possible to reliably determine the phylogenetic position of B. anthracis strains and is promising for use in the epidemiological investigation of anthrax outbreaks.

Введение. Bacillus anthracis — возбудитель особо опасного зооноза сибирской язвы — отличается высокой генетической однородностью, что вызывает необходимость совершенствования методов генотипирования.

Целями исследования были поиск, описание VNTR- и INDEL-локусов B. anthracis и разработка на их основе методики генотипирования посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР) с электрофоретической детекцией результатов.

Материалы и методы. Поиск VNTR- и INDEL-маркеров и филогенетический анализ выполняли на выборке из 388 геномов штаммов B. anthracis: 322 из GenBank (RefSeq) и 66 — из коллекции Ставропольского противочумного института. Филогенетический анализ проводили на основе SNP корового выравнивания с помощью программы «Parsnp». Поиск маркеров осуществляли с использованием программы «Mauve» и авторских скриптов на языке Python. ПЦР выполняли с помощью набора «ScreenMix-HS».

Результаты. Найдены геномные вариации штаммов B. anthracis (SNP — 25 664, SNR — 14 387, VNTR — 693, INDEL — 14 667), биоинформатический анализ которых позволил выявить 9 новых VNTR и 6 INDEL молекулярных маркеров, наиболее подходящих для генотипирования. Описаны генетические (аллельные) варианты маркеров. Для найденных маркеров подобраны праймеры и разработан протокол ПЦР c детекцией методом электрофореза в агарозном геле. В результате кластеризации при типировании с использованием VNTR-маркеров штаммы разделялись на 9 кластеров: A.Br.Ames, A.Br.001/002, A.Br.Aust94, A.Br.005/006, A.Br.008/009 (Tsiankovskii), A.Br.008/009 (STI), A.Br.008/009 (A.Br.125), A.Br.008/009 (штамм 228/269), B.Br.001/002. При типировании с применением INDEL-маркеров штаммы разделялись на 6 кластеров: A.Br.Ames, A.Br.001/002, A.Br.Aust94, A.Br.008/009 (Tsiankovskii), B.Br.001/002(B.Br.014), а также кластер, включающий представителей нескольких генетических групп: A.Br.008/009 (STI), A.Br.008/009 (A.Br.125), A.Br.005/006 и B.Br.001/002.

Заключение. Использование разработанной методики идентификации вариабельных VNTR- и INDEL-локусов позволяет достоверно определять филогенетическое положение штаммов B. anthracis и перспективно для применения в процессе эпидемиологического расследования вспышек сибирской язвы.

genotypingVNTRINDELBacillus anthraciswhole genome sequencingphylogenetic analysisгенотипированиеVNTRINDEL Bacillus anthracisполногеномное секвенированиефилогенетический анализHarrell L.J., Andersen G.L., Wilson K.H. Genetic variability of Bacillus anthracis and related species. J. Clin. Microbiol. 1995;33(7):1847–50. DOI: https://doi.org/1128/jcm.33.7.1847-1850.1995Andersen G.L., Simchock J.M., Wilson K.H. Identification of a region of genetic variability among Bacillus anthracis strains and related species. J. Bacteriol. 1996;178(2):377–84. DOI: https://doi.org/1128/jb.178.2.377-384.1996Jackson P.J., Walthers E.A., Kalif A.S., et al. Characterization of the variable-number tandem repeats in vrrA from different Bacillus anthracis isolates. Appl. Environ. Microbiol. 1997;63(4):1400–5. DOI: https://doi.org/1128/aem.63.4.1400-1405.1997Pearson T., Busch J.D., Ravel J., et al. Phylogenetic discovery bias in Bacillus anthracis using single-nucleotide polymorphisms from whole-genome sequencing. Proc. Natl Acad. Sci. 2004;101(37):13536–41. DOI: https://doi.org/1073/pnas.0403844101Keim P., Price L.B., Klevytska A.M., et al. Multiple-locus variable-number tandem repeat analysis reveals genetic relationships within Bacillus anthracis. J. Bacteriol. 2000;182(10):2928–36. DOI: https://doi.org/1128/jb.182.10.2928-2936.2000Le Flèche P., Hauck Y., Onteniente L., et al. A tandem repeats database for bacterial genomes: application to the genotyping of Yersinia pestis and Bacillus anthracis. BMC Microbiol. 2001;1:2. DOI: https://doi.org/1186/1471-2180-1-2Lista F., Faggioni G., Valjevac S., et al. Genotyping of Bacillus anthracis strains based on automated capillary 25-loci multiple locus variable-number tandem repeats analysis. BMC Microbiol. 2006;6:33. DOI: https://doi.org/1186/1471-2180-6-33Van Ert M.N., Easterday W.R., Huynh L.Y., et al. Global genetic population structure of Bacillus anthracis. PLoS One. 2007;2(5):e461. DOI: https://doi.org/1371/journal.pone.0000461Beyer W., Bellan S., Eberle G., et al. Distribution and molecular evolution of Bacillus anthracis genotypes in Namibia. PLoS Negl. Trop. Dis. 2012;6(3):e1534. DOI: https://doi.org/1371/journal.pntd.0001534Thierry S., Tourterel C., Le Flèche P., et al. Genotyping of French Bacillus anthracis strains based on 31-loci multi locus VNTR analysis: epidemiology, marker evaluation, and update of the internet genotype database. PLoS One. 2014;9(6):e95131. DOI: https://doi.org/1371/journal.pone.0095131Sahl J.W., Pearson T., Okinaka R., et al. A Bacillus anthracis genome sequence from the Sverdlovsk 1979 autopsy specimens. mBio. 2016;7(5):e01501–16. DOI: https://doi.org/1128/mBio.01501-16Eremenko E., Pechkovskii G., Pisarenko S., et al. Phylogenetics of Bacillus anthracis isolates from Russia and bordering countries. Infect. Genet. Evol. 2021;92:104890. DOI: https://doi.org/1016/j.meegid.2021.104890Larsson P., Svensson K., Karlsson L., et al. Canonical insertion-deletion markers for rapid DNA typing of Francisella tularensis. Emerg. Infect. Dis. 2007;13(11):1725–32. DOI: https://doi.org/3201/eid1311.070603Сорокин В.М., Водопьянов А.С., Писанов Р.В. INDEL-типирование — новый метод дифференциации штаммов Helicobacter pylori. Бактериология. 2020;5(1):8–13. Sorokin V.M., Vodop'yanov A.S., Pisanov R.V. INDEL-typing: a new method of differentiation of Helicobacter pylori strains. Bacteriology. 2020;5(1):8–13. DOI: https://doi.org/20953/2500-1027-2020-1-8-13Леденева М.Л., Водопьянов А.С., Ткаченко Г.А. и др. Выявление INDEL-маркеров в геномах штаммов Burkholderia pseudomallei для внутривидового генотипирования. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2017;(4): 35–41. Ledeneva M.L., Vodop'yanov A.S., Tkachenko G.A., et al. Detection of INDEL-markers in genomes of Burkholderia pseudomallei strains for intra-species genotyping. Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology. 2017;(4): 35–41. DOI: https://doi.org/36233/0372-9311-2017-4-35-41 EDN: https://elibrary.ru/bucgfmВодопьянов А.С., Водопьянов С.О., Олейников И.П., Мишанькин Б.Н. INDEL-типирование штаммов Vibrio cholerae. Эпидемиология и инфекционные болезни. 2017;22(4):195–200. Vodop'yanov A.S., Vodop'yanov S.O., Oleinikov I.P., Mishan'kin B.N. Indel-genotyping of Vibrio cholerae strains. Epidemiology and Infectious Diseases. 2017;22(4):195–200. DOI: https://doi.org/18821/1560-9529-2017-22-4-195-200 EDN: https://elibrary.ru/zhlhhhТрухачев А.Л., Мелоян М.Г., Воскресенская Е.А. и др. INDEL-типирование штаммов Yersinia pseudotuberculosis. Проблемы особо опасных инфекций. 2022;(4):102–9. Trukhachev A.L., Meloyan M.G., Voskresenskaya E.A., et al. INDEL-typing of Yersinia pseudotuberculosis strains. Problems of Particularly Dangerous Infections. DOI: https://doi.org/21055/0370-1069-2022-4-102-109 EDN: https://elibrary.ru/rucepzTamura K., Stecher G., Kumar S. MEGA11: molecular evolutionary genetics analysis version 11. Mol. Biol. Evol. 2021; 38(7):3022–7. DOI: https://doi.org/1093/molbev/msab120Еременко Е.И., Рязанова А.Г., Писаренко С.В. и др. Новые генетические маркеры для молекулярного типирования штаммов Bacillus anthracis. Проблемы особо опасных инфекций. 2019;(3):43–50. Eremenko E.I., Ryazanova A.G., Pisarenko S.V., et al. New genetic markers for molecular typing of Bacillus anthracis strains. Problems of Particularly Dangerous Infections. 2019;(3):43–50. DOI: https://doi.org/21055/0370-1069-2019-3-43-50 EDN: https://elibrary.ru/pgefkdHunter P.R., Gaston M.A. Numerical index of the discriminatory ability of typing systems: an application of Simpson's index of diversity. J. Clin. Microbiol. 1988;26(11):2465–6. DOI: https://doi.org/10.1128/jcm.26.11.2465-2466.1988