Journal of microbiology, epidemiology and immunobiologyJournal of microbiology, epidemiology and immunobiologyЖурнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии0372-93112686-7613Central Research Institute for Epidemiology1583710.36233/0372-9311-364phcmoqSCIENCE AND PRACTICEНАУКА И ПРАКТИКАResearch ArticleProduction of Bst polymerase for diagnosis of different infections using loop-mediated isothermal amplificationПолучение Bst-полимеразы для диагностики различных инфекций методом петлевой изотермической амплификацииhttps://orcid.org/0000-0002-3279-6811PikaMaria I.ПикаМария Игоревна
Russian Federation

junior researcher, Research group of genetic engineering and biotechnology

м.н.с., научная группа генной инженерии и биотехнологии, отдел молекулярной диагностики и эпидемиологии

cherkashina@pcr.mshttps://orcid.org/0000-0002-1721-5134MikheevaOlga O.МихееваОльга Олеговна
Russian Federation

researcher, Research group of genetic engineering and biotechnology

н.с., научная группа генной инженерии и биотехнологии, отдел молекулярной диагностики и эпидемиологии

cherkashina@pcr.mshttps://orcid.org/0000-0002-0762-0347SolovyovaElena D.СоловьеваЕлена Дмитриевна
Russian Federation

junior researcher, Research group of genetic engineering and biotechnology

м.н.с., научная группа генной инженерии и биотехнологии, отдел молекулярной диагностики и эпидемиологии

cherkashina@pcr.mshttps://orcid.org/0000-0002-4592-4755ValdokhinaAnna V.ВалдохинаАнна Владимировна
Russian Federation

researcher, Research group of genetic engineering and biotechnology

н.с., научная группа генной инженерии и биотехнологии, отдел молекулярной диагностики и эпидемиологии

cherkashina@pcr.mshttps://orcid.org/0000-0001-7055-1762BulanenkoVictoria P.БуланенкоВиктория Петровна
Russian Federation

researcher, Research group of genetic engineering and biotechnology

н.с., научная группа генной инженерии и биотехнологии, отдел молекулярной диагностики и эпидемиологии

cherkashina@pcr.mshttps://orcid.org/0000-0002-3627-6047CherkashinEvgeny A.ЧеркашинЕвгений Александрович
Russian Federation

Cand. Sci. (Chem.), Head, Center for development, product development and innovation — Deputy head, Production department

канд. хим. наук, рук. центра разработки, развития продукции и инноваций — ВРИО заведующего научно-производственной лаборатории

cherkashina@pcr.mshttps://orcid.org/0000-0002-3503-2366PetrovVadim V.ПетровВадим Викторович
Russian Federation

Head, Research group of development of new molecular biological technologies

рук. научной группы разработки новых молекулярно-биологических технологий, отдел молекулярной диагностики и эпидемиологии

cherkashina@pcr.mshttps://orcid.org/0000-0001-7237-1810KrasovitovKirill V.КрасовитовКирилл Владимирович
Russian Federation

technologist-developer, Research group of development of new molecular biological technologies

технолог-разработчик, научная группа разработки новых молекулярно-биологических технологий, отдел молекулярной диагностики и эпидемиологии

cherkashina@pcr.mshttps://orcid.org/0000-0001-7970-7495CherkashinaAnna S.ЧеркашинаАнна Сергеевна
Russian Federation

Cand. Sci. (Chem.), Head, Research group of genetic engineering and biotechnology

к.хим.н., рук. научной группы генной инженерии и биотехнологии, отдел молекулярной диагностики и эпидемиологии

cherkashina@pcr.mshttps://orcid.org/0000-0003-4228-9044AkimkinVasily G.АкимкинВасилий Геннадиевич
Russian Federation

D. Sci. (Med.), Professor, Academician of the Russian Academy of Sciences, Director

д.м.н., проф., академик РАН, член-корреспондент РАМН, директор

cherkashina@pcr.msCentral Research Institute of EpidemiologyЦентральный научно-исследовательский институт эпидемиологии Роспотребнадзора1107202310032102181107202311072023Copyright ©; 2023, Pika M.I., Mikheeva O.O., Solovyova E.D., Valdokhina A.V., Bulanenko V.P., Cherkashin E.A., Petrov V.V., Krasovitov K.V., Cherkashina A.S., Akimkin V.G.Copyright ©; 2023, Пика М.И., Михеева О.О., Соловьева Е.Д., Валдохина А.В., Буланенко В.П., Черкашин Е.А., Петров В.В., Красовитов К.В., Черкашина А.С., Акимкин В.Г.2023Pika M.I., Mikheeva O.O., Solovyova E.D., Valdokhina A.V., Bulanenko V.P., Cherkashin E.A., Petrov V.V., Krasovitov K.V., Cherkashina A.S., Akimkin V.G.Пика М.И., Михеева О.О., Соловьева Е.Д., Валдохина А.В., Буланенко В.П., Черкашин Е.А., Петров В.В., Красовитов К.В., Черкашина А.С., Акимкин В.Г.https://creativecommons.org/licenses/by/4.0https://microbiol.crie.ru/jour/article/view/15837

Introduction. The large fragment of DNA polymerase I from Geobacillus stearothermophilus GIM1.543 (Bst DNA polymerase) possesses 5'-3' DNA polymerase activity, 5'-3' displacement activity and high processivity. These properties make it possible to use Bst DNA polymerase in loop-mediated isothermal amplification (LAMP), which provides highly specific amplification of the target sequence and is used for rapid detection of agents causing human infectious diseases.

The purpose of the study was to produce a recombinant Bst polymerase enzyme in the bacterial expression system and to assess its properties for LAMP-based diagnostics of infectious diseases.

Materials and methods. Expression constructs carrying the Bst polymerase gene were obtained using genetic engineering techniques. Different Escherichia coli strains were used for protein expression. Metal-chelate and gel filtration chromatography techniques were used for protein purification. Catalytic characteristics of the enzyme were assessed in loop-mediated isothermal amplification reactions using AmpliSens® SARS-CoV-2-IT, AmpliSens® IAV-IT and AmpliSens® IBV-IT diagnostic systems designed for high-quality detection of SARS-CoV-2, influenza A virus (IAV) and influenza B virus (IBV) RNA, respectively.

Results. The offered protocol for production, extraction and purification of recombinant Bst polymerase makes it possible to produce the enzyme in the bacterial expression system using E. coli cells in a soluble form and reaching the yield up to 20% of the total cell mass. In LAMP reactions, the obtained enzyme demonstrates activity comparable with that of the commercial enzyme Bst 2.0 (NEB).

Conclusion. Considering the fast purification and production of the enzyme, the obtained recombinant Bst polymerase can be used in LAMP-based diagnostic kits.

Введение. Большой фрагмент ДНК-полимеразы I из Geobacillus stearothermophilus GIM1.543 (ДНК-полимераза Bst) обладает 5'-3'-ДНК-полимеразной активностью, 5'-3'-вытесняющей активностью и высокой процессивностью. Благодаря этим свойствам ДНК-полимераза Bst используется в петлевой изотермической амплификации (LAMP), которая обеспечивает амплификацию целевой последовательности с высокой специфичностью и применяется для быстрого обнаружения возбудителей инфекционных заболеваний человека.

Цель работы — получение рекомбинантного фермента Bst-полимеразы в бактериальной системе экспрессии и оценка его свойств в условиях LAMP для диагностики инфекционных заболеваний.

Материалы и методы. Методами генетической инженерии получали экспрессионные конструкции, несущие ген Bst-полимеразы. Экспрессию белка проводили в различных штаммах клеток Escherichia coli. Для получения очищенных препаратов белка использовали методы металл-хелатной и гель-фильтрационной хроматографии. Оценку каталитических свойств фермента проводили в реакциях петлевой изотермической амплификации в диагностических системах «АмплиСенс® SARS-CoV-2-IT», «АмплиСенс® IAV-IT» и «АмплиСенс® IBV-IT», предназначенных для качественного определения РНК SARS-CoV-2, вируса гриппа А (IAV) и вируса гриппа B (IBV) соответственно.

Результаты. Разработанный протокол наработки, выделения и очистки рекомбинантной Bst-полимеразы позволяет получать фермент в бактериальной системе экспрессии на основе клеток E. coli в растворимой форме с выходом до 20% от собранной клеточной массы. В реакциях LAMР полученный фермент демонстрирует активность, сопоставимую с коммерческим ферментом Bst 2.0 («NEB»).

Заключение. Полученная рекомбинантная Bst-полимераза, учитывая быстрый способ очистки и получения фермента, пригодна для применения в диагностических наборах на основе LAMP.

polymeraseisothermal amplificationrecombinant enzymeполимеразаизотермическая амплификациярекомбинантный ферментТhe research was funded by the State budget (Federal project "Sanitary shield of the country — safety for health (prevention, detection, response)”).Исследование выполнено за счёт государственного бюджета (федеральный проект «Санитарный щит страны — безопасность для здоровья (предупреждение, выявление, реагирование)»).Notomi T., Okayama H., Masubuchi H., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 2000; 28(12):E63. DOI: https://doi.org/10.1093/nar/28.12.e63Oscorbin I.P., Boyarskikh U.A., Filipenko M.L. Large fragment of DNA polymerase I from Geobacillus sp. 777: cloning and comparison with DNA polymerases I in practical applications. Mol. Biotechnol. 2015;57(10):947–59. DOI: https://doi.org/10.1007/s12033-015-9886-xBecherer L., Borst N., Bakheit M., et al. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP)-review and classification of methods for sequence-specific detection. Anal. Methods. 2020;12(6):717–46. DOI: https://doi.org/10.1039/C9AY02246ESoroka M., Wasowicz B., Rymaszewska A. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): The better sibling of PCR? Cells. 2021;10(8):1931. DOI: https://doi.org/10.3390/cells10081931Moore K.J.M., Cahill J., Aidelberg G., et al. Loop-mediated isothermal amplification detection of SARS-CoV-2 and myriad other applications. J. Biomol. Tech. 2021;32(3):228–75. DOI: https://doi.org/10.7171/jbt.21-3203-017Акимкин В.Г., Петров В.В., Красовитов К.В. и др. Молеку- лярные методы диагностики новой коронавирусной инфекции: сравнение петлевой изотермической амплификации и полимеразной цепной реакции. Вопросы вирусологии. 2021; 66(6):417–424. Akimkin V.G., Petrov V.V., Krasovitov K.V., et al. Molecular methods for diagnosing novel coronavirus infection: comparison of loop-mediated isothermal amplification and polymerase chain reaction. Problems of Virology. 2021;66(6):417–424. DOI: https://doi.org/10.36233/0507-4088-86Takayama I., Nakauchi M., Takahashi H., et al. Development of real-time fluorescent reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay with quenching primer for influenza virus and respiratory syncytial virus. J. Virol. Methods. 2019;267:53–8. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jviromet.2019.02.010Wang Q.Q., Zhang J., Hu J.S., et al. Rapid detection of hepatitis C virus RNA by a reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2011;63(1):144–7. DOI: https://doi.org/10.1111/j.1574-695X.2011.00828.xParida M., Horioke K., Ishida H., et al. Rapid detection and differentiation of dengue virus serotypes by a real-time reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification assay. J. Clin. Microbiol. 2005;43(6):2895–903. DOI: https://doi.org/10.1128/JCM.43.6.2895-2903.2005Curtis K.A., Rudolph D.L., Owen S.M. Rapid detection of HIV-1 by reverse-transcription, loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP). J. Virol. Methods. 2008;151(2):264–70. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jviromet.2008.04.011Kurosaki Y., Takada A., Ebihara H., et al. Rapid and simple detection of Ebola virus by reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification. J. Virol. Methods. 2007;141(1):78–83. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jviromet.2006.11.031Wada K., Suzuki H. Biotechnological platforms of the moderate thermophiles, Geobacillus species: notable properties and genetic tools. In: Salwan R., Sharma V., eds. Physiological and Biotechnological Aspects of Extremophiles. Academic Press; 2020:195–218. DOI: https://doi.org/10.1016/C2018-0-03860-8Stenesh J., Roe B.A. DNA polymerase from mesophilic and thermophilic bacteria: I. Purification and properties of DNA polymerase from Bacillus licheniformis and Bacillus stearothermophilus. Biochim. Biophys. Acta. 1972;272:156–66. DOI: https://doi.org/10.1016/0005-2787(72)90240-7Kaboev O.K., Luchkina L.A., Akhmedov A.T., Bekker M.L. Purification and properties of deoxyribonucleic acid polymerase from Bacillus stearothermophilus. J. Bacteriol. 1981;145(1):21–6. DOI: https://doi.org/10.1128/jb.145.1.21-26.1981Steitz T.A. DNA polymerases: structural diversity and common mechanisms. J. Biol. Chem. 1999;274(25):17395–8. DOI: https://doi.org/10.1074/jbc.274.25.17395Phang S.M., Teo C.Y., Lo E., Wong V.W. Cloning and complete sequence of the DNA polymerase-encoding gene (BstpolI) and characterisation of the Klenow-like fragment from Bacillus stearothermophilus. Gene. 1995;163(1):65–8. DOI: https://doi.org/10.1016/0378-1119(95)00387-lLawyer F.C., Stoffel S., Saiki R.K., et al. High-level expression, purification, and enzymatic characterization of full-length Thermus aquaticus DNA polymerase and a truncated form deficient in 5′ to 3′ exonuclease activity. PCR Methods Appl. 1993;2(4):275–87. DOI: https://doi.org/10.1101/gr.2.4.275Li P., Amenov A., Kalendar R., et al. Cloning and purification of large fragment of DNA polymerase I from Geobacillus stearothermophilus and it’s application in isothermal DNA amplification. Eurasian Journal of Applied Biotechnology. 2017;(1):50–8. DOI: https://doi.org/10.11134/btp.1.2017.6. EDN: https://www.elibrary.ru/zbenmtKordyukova M.Y., Antipova V.N., Rogachevsky V.V., Zyrina NV. An acid precipitation technique: A strip assay for the large-scale DNA polymerase activity screening. Anal. Biochem. 2016;513:39–42. DOI: https://doi.org/10.1016/j.ab.2016.08.022Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970; 227(5259):680–5. DOI: https://doi.org/10.1038/227680a0Черкашина А.С., Пика М.И., Михеева О.О. и др. ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора. Способ получения большого фрагмента Bst-полимеразы. Заявка на патент RU 2022135005. Заявл. 28.12.2022. Cherkashina A.S., Pika M.I., Mikheeva O.O., et al. CRIE. Method for obtaining a large fragment of Bst-polymerase. Patent application RU 2022135005; 28.12.2022.