Journal of microbiology, epidemiology and immunobiologyJournal of microbiology, epidemiology and immunobiologyЖурнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии0372-93112686-7613Central Research Institute for Epidemiology14220ArticlesСтатьиResearch ArticleIMPROVEMENT OF METHODS FOR IDENTIFICATION OF ATYPICAL ANTHRAX STRAINS AND THEIR DIFFERENTIATION FROM CLOSELY RELATED BACILLIУСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ ИДЕНТИФИКАЦИИ АТИПИЧНЫХ ШТАММОВ ВОЗБУДИТЕЛЯ СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ И ИХ ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ ОТ БЛИЗКОРОДСТВЕННЫХ БАЦИЛЛRyazanovaA. GРязановаА. ГEremenkoE. IЕременкоЕ. ИTsygankovaO. IЦыганковаО. ИTsygankovaE. AЦыганковаЕ. АStavropol Research Institute for Plague Control, Stavropol, RussiaСтавропольский научно-исследовательский противочумный институт15062009863NO3 (2009)768013062023Copyright ©; 2009, Ryazanova A.G., Eremenko E.I., Tsygankova O.I., Tsygankova E.A.Copyright ©; 2009, Рязанова А.Г., Еременко Е.И., Цыганкова О.И., Цыганкова Е.А.2009Ryazanova A.G., Eremenko E.I., Tsygankova O.I., Tsygankova E.A.Рязанова А.Г., Еременко Е.И., Цыганкова О.И., Цыганкова Е.А.https://creativecommons.org/licenses/by/4.0https://microbiol.crie.ru/jour/article/view/14220

Aim. To study biologic characteristics of atypical strains of anthrax agent in order to improve methods of identification and differentiation from closely related bacilli. Materials and methods. Objects of the study were 1101 strains of microorganisms of which following were experimentally examined: atypical — 40 strains, typical — 2, saprophytic bacilli from Bacillus genus — 50. Aside from conventional methods, additional tests for intraspecies differentiation as well as multiplex PCR method were used for identification. Results. Isolation rate of atypical strains of anthrax agent in natural conditions as well as frequency of misidentification of bacillary strains as Bacillus anthracis was assessed. Phenotypical test for determination of susceptibility to penicillin was improved. Variant of multiplex PCR for differentiation of B.anthracis strains with any set of plasmids from closely related bacilli strains was developed. Feasibility to use multiple loci analysis of 6 chromosomal and 2 plasmid regions of B.anthracis genome containing variable number of tandem repeats (MLVA) for differentiation of B.anthracis strains from other bacilli from Bacillus genus was demonstrated. Conclusion. In order to optimize the processes of identification of B.anthracis typical and atypical strains and differentiation between closely related bacilli, it is rational to use disk-diffusion method with commercially available disks of penicillin, multiprimer PCR and MLVA on 6 chromosomal and 2 plasmid loci.

Цель. Исследование биологических свойств атипичных штаммов возбудителя сибирской язвы для усовершенствования методов идентификации и дифференциации от близкородственных бацилл. Материалы и методы. Объектом исследования был 1101 штамм микроорганизмов, из которых экспериментально изучено: атипичных — 40, типичных — 2, сапрофитных бацилл рода Bacillus — 50. Для идентификации кроме общепринятых методов проведены дополнительные тесты для внутривидовой дифференциации, а также метод мультиплексной ПЦР. Результаты. Оценена частота выделения атипичных штаммов возбудителя сибирской язвы в природных условиях, а также частота ошибок в идентификации штаммов бацилл как Bacillus anthracis. Усовершенствован фенотипический тест для определения чувствительности к пенициллину. Разработан вариант мультиплексной ПЦР для дифференциации штаммов B. anthracis с любым набором плазмид от штаммов близкородственных бацилл. Показана возможность использования многолокусного анализа 6 хромосомных и 2 плазмидных областей генома B.anthracis с вариабельным числом тандемных повторов (MLVA) для дифференциации штаммов возбудителя сибирской язвы от бацилл рода Bacillus. Заключение. Для оптимизации процессов идентификации типичных и атипичных штаммов B. anthracis и дифференциации близкородственных бацилл целесообразно использовать дискодиффузионный метод с коммерческими дисками пенициллина, мультипраймерную ПЦР и метод MLVA по 6 хромосомным и 2 плазмидным локусам.

Bacillus anthracisatypical strainsclosely related bacilliidentificationdifferentiationloci with variable number of tandem repeatsатипичные штаммыблизкородственные бациллыидентификациядифференциациялокусы с вариабельным числом тандемных повторовЕременко Е.И. Потребности сибиреязвенного микроба в факторах роста и новые питательные среды для его культивирования. Автореф. дис. канд. мед. наук. Саратов, 1986.Еременко Е.И. Биологические и популяционные аспекты патогенности Bacillus anthracis. Автореф. дис. д-ра мед. наук. Саратов, 1997.Методические указания «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам». МУК 4.2.1890-04.Методические указания «Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами I-II групп патогенности». МУ 1.3.1794-03. М., 2003.Руководство «Лабораторная диагностика возбудителей опасных инфекционных болезней». Саратов, 1998.Цыганкова О.И. Гемолитическая и протеолитическая активность сибиреязвенного микроба. Автореф. дис. канд. мед. наук. Саратов, 1993.Цыганкова О.И., Еременко Е.И., Брюханов А.Ф. и др. Генотипирование штаммов сибиреязвенного микроба на территории стран СНГ. Журн. микробиол. 2003, 6 (прил.): 51—56.Цыганкова О.И., Еременко Е.И., Рязанова А.Г., Цыганкова Е.А. Мультиплексная амплификационная тест-система для идентификации и дифференциации Bacillus anthracis. Там же. 2005, 3: 69—74.Dwyer K.G., Lamonica J.M., Schumacher J.A. et al. Identification of Bacillus anthracis specific chromosomal sequences by suppressive subtractive hybridization. BMC Genomics. 2004, 5: 15. http://www.biomedcentral.com/1471-2164/5/15.Hoffmaster A.R., Hill K.K., Gee J.E. et al. Characterization of Bacillus cereus isolates associated with fatal pneumonias: strains are closely related to Bacillus anthracis and harbor B.anthracis virulence genes. J. Clin. Microbiol. 2006, 44 (9): 3352—3360.Keim P., Price L.B., Klevytska A.M. et al. Multiple locus variable namber tandem repeat analysis reveals genetic relationships within Bacillus anthracis. J. Bacteriol. 2000, 182 (10): 2928—2936.Ramisse V., Patra G., Garringue H. et al. Identification and characterization of Bacillus anthracis by multiplex PCR analysis of sequences on plasmids pXO1 and pXO2 and chromosomal DNA. FEMS Microbiol. Lett. 1996, 145: 9—16.