Journal of microbiology, epidemiology and immunobiologyJournal of microbiology, epidemiology and immunobiologyЖурнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии0372-93112686-7613Central Research Institute for Epidemiology14110.36233/0372-9311-2017-2-45-53ORIGINAL RESEARCHESОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯINCLUSION OF SITE-SPECIFIC MUTATIONS INTO CONSERVATIVE SEGMENTS OF РА-GENE RESULTS IN ATTENUATION OF VIRULENT INFLUENZA VIRUS STRAIN A/WSN/33ВКЛЮЧЕНИЕ САЙТ-СПЕЦИФИЧЕСКИХ МУТАЦИЙ В КОНСЕРВАТИВНЫЕ УЧАСТКИ РА-ГЕНА ПРИВОДИТ К АТТЕНУАЦИИ ВИРУЛЕНТНОГО ШТАММА ВИРУСА ГРИППА A/WSN/33RtischevA. A.РтищевА. А.
Russian Federation
MintaevR. R.МинтаевР. Р.
Russian Federation
KostV. Yu.КостВ. Ю.
Russian Federation
KoptyaevaI. B.КоптяеваИ. Б.
Russian Federation
AkopovaI. I.АкоповаИ. И.
Russian Federation
LisovskayaK. V.ЛисовскаяК. В.
Russian Federation
MarkushinS. G.МаркушинС. Г.
Russian Federation
Mechnikov Research Institute of Vaccines and SeraНИИ вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова28042017942455310042019Copyright ©; 2017, Rtischev A.A., Mintaev R.R., Kost V.Y., Koptyaeva I.B., Akopova I.I., Lisovskaya K.V., Markushin S.G.Copyright ©; 2017, Ртищев А.А., Минтаев Р.Р., Кост В.Ю., Коптяева И.Б., Акопова И.И., Лисовская К.В., Маркушин С.Г.2017Rtischev A.A., Mintaev R.R., Kost V.Y., Koptyaeva I.B., Akopova I.I., Lisovskaya K.V., Markushin S.G.Ртищев А.А., Минтаев Р.Р., Кост В.Ю., Коптяева И.Б., Акопова И.И., Лисовская К.В., Маркушин С.Г.https://creativecommons.org/licenses/by/4.0https://microbiol.crie.ru/jour/article/view/141

Aim. Study the possibility of obtaining attenuated variants of influenza virus by including specially selected site-specific mutations into a conservative sequence of PA-gene (terminal segment of COOH-domain of the PA-gene) of a virulent strain. Materials and methods. А/ WSN/33 - a virulent strain of influenza virus was used in the study. I nclusion of site-specific mutations into PA-gene of the A/WSN/33 virulent strain was carried out using a two-step mutation PCR. Cloning was carried out using GoldenGate reaction. 8-plasmid transfection system based on pHW2000 vector was used. Transformation was carried out in rubidium competent bacterial cells of DH5a strain. Transfection was done using Lipofectamine LTX (Invitrogen) reagent in a 293T and MDCK cells’ co-culture. Results. Transfectants with F658A substitution in the COOH-domain of the PA-gene were shown to acquire ts-phenotype and sharply reduce the ability to reproduce in mice lungs. Introduction of F658A substitution into COOH-domain of the PA-gene in combination with introduction of ts-mutations from ca influenza virus strains into the genome of the virulent strain resulted in obtaining transfectants that have phenotypic characteristics typical for live influenza vaccine candidates. Conclusion. The ability to obtain attenuated variants of influenza viruses by introducing specially selected site-specific mutations into conservative sequence of the PA-gene is shown.

Иель. Исследование возможности получения аттенуированных вариантов вируса гриппа с помощью включения специально подобранных сайт-специфических мутаций консервативную последовательность РА-гена (концевую часть СООН-домена РА-ена) вирулентного штамма. Материалы и методы. В работе был использован вирулентный штамм вируса гриппа A/WSN/33. Включение сайт-специфических мутаций РА-ген вирулентного штамма A/WSN/33 проводили с помощью двуступенчатой мутационной ПЦР. Клонирование осуществляют, используя GoldenGate реакцию. Использовали 8-плазмидную трансфекционную систему на основе вектора pH W2000. Трансформацию проводили на рубидиевых компетентных бактериальных клетках штамма DH5a. Трансфекцию делали при помощи реагента LipofectamineLTX(Invitro-;гп) в кокультуре клеток 293Т и MDCK. Результаты. Показано, что трансфектанты, содержащие замену F658A в СООН-домене РА-гена, приобрели ts-фенотип и резко снизили способность к размножению в легких мышей. Включение замены F658A в СООН-домен РА-гена в комбинации с включением в геном вирулентного штамма ts-мутаций из генов ХА штаммов вируса гриппа приводило к получению трансфектантов, обладающих фенотипическими характеристиками, типичными зля кандидатов в живые гриппозные вакцины. Заключение. Показана возможность получения аттенуированных вариантов вируса гриппа путем включения специально подобранных сайт-специфических мутаций в консервативную последовательность РА-гена.

influenza virussite-specific mutationstransfectantsattenuationPA-geneвирус гриппасайт-специфические мутациитрансфектантыаттенуацияРА-генАлексадрова Г.И., Климов А.И. Живая вакцина против гриппа. Санкт-Петербург. Наука, 1994.Гендон Ю.З., Маркушин С.Г., Цфасман Т.М. и др. Новые холодоадаптированные штаммы-доноры аттенуации для живых вакцин против гриппа. Вопросы вирусологии. 2013, 1: 11-17.Da Costa В., Sausset A., Munier S. et al. Temperature-sensitive mutants in the influenza A virus RNA polymerase: alterations in the PA linker reduce nuclear targeting of the PB1 -PA dimer and result in viral attenuation. J. Virol. 2015, 89 (12): 6376- 6390.Hickman D., Hossain J., Song H. et al. An avian live attenuated master backbone for potential use in epidemic and pandemic influenza vaccines. J. Gen. Virol. 2008, 89: 2682-2690.Hoffmann E., Neumann G., Hobom G. et al. Ambisense approach for the generation o: influenza A virus: vRNAand mRNA synthesis from one template. Virology. 2000,267 (2) 310-317.Jin H., Zhou H., Lu B. et al. Imparting temperature sensitivity and attenuation in ferret; to A/Puerto Rico/8/34 influenza vims by transferring the genetic signature for temperature sensitivity from cold-adapted A/Ann Arbor/6/60. J. Virol. 2004, 78 (2): 995-998.Parkin N., Chiu P., Coelingh K. Genetically engineering live attenuated influenza A viru.' vaccine candidates. J. Virol. 1997, 71 (4): 2772-2778.Pena L., Vincent A., Ye J. et al. Modifications in the polymerase genes of a swine-likc triple-reassortant influenza vims to generate live attenuated vaccines against 2009 pandemic H1N1 viruses. J. Virol. 2011, 85 (1): 456-469.Solorzano A.,Li Yo., Perez D.R. Alternative live - attenuated influenza vaccines based or. modification in the polymerase genes protect against epidemic and pandemic flu. J. Virol 2010,84 (9): 4587-4596.Song H., Nieto G., Perez D. A new generation of modified live-attenuated avian influenza viruses using a two-strategy combination as potential vaccine candidates. J. Virol. 2007,81 (17):9238-9248.Subbarao E.K., Kawaoka Y.,Murphy B.R. Rescue of an influenza A virus wild-type '227PB2 gene and a mutant derivative bearing a site-specific temperature - sensitive and attenuating mutation. J. Virol. 1993, 67 (12): 7223- 7227.Subbarao K., ParkE., Lawson C.etal. Sequential addition temperature-sensitive missense mutations into the PB2 gene of influenza A transfectant viruses can effect an increase in temperature sensitivity and attenuation and permits the rational design of a genetically engineered live influenza A virus vaccine. J. Virol. 1995, 69 (10): 5969-5977.Zhou B., Li Yo., Speer S. et al. Engineering temperature sensitive live attenuated influenza vaccines from emerging viruses. Vaccine. 2012, 30 (24): 3691-3702.