Journal of microbiology, epidemiology and immunobiologyJournal of microbiology, epidemiology and immunobiologyЖурнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии0372-93112686-7613Central Research Institute for Epidemiology13995ArticlesСтатьиResearch ArticleEVALUATION OF REAL-TIME MULTIPLEX PCR EFFECTIVENESS FOR GROUP A ROTAVIRUS GENOTYPINGОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ МУЛЬТИПЛЕКСНОЙ ПЦР В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ ДЛЯ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ РОТАВИРУСОВ ГРУППЫ АBakhtoyarovG. NБахтояровГ. НKiselevI. SКиселевИ. СZverevV. VЗверевВ. ВFaizuloevE. BФайзулоевЕ. БMechnikov Research Institute of Vaccines and Sera, Moscow, RussiaНИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова, Москва15082014914NO4 (2014)№4 (2014)434909062023Copyright ©; 2014, Bakhtoyarov G.N., Kiselev I.S., Zverev V.V., Faizuloev E.B.Copyright ©; 2014, Бахтояров Г.Н., Киселев И.С., Зверев В.В., Файзулоев Е.Б.2014Bakhtoyarov G.N., Kiselev I.S., Zverev V.V., Faizuloev E.B.Бахтояров Г.Н., Киселев И.С., Зверев В.В., Файзулоев Е.Б.https://creativecommons.org/licenses/by/4.0https://microbiol.crie.ru/jour/article/view/13995

Aim. Evaluate resolution and diagnostic significance of real-time multiplex PCR (MP RT-PCR) as a platform for group A rotavirus G/P genotyping test-systems. Materials and methods. Primer and DNA probe construction for an experimental test-system based on MP RT-PCR was carried out by using specialized PC programs and sequence databases GenBank NCBI, EMBL Nucleotide Sequence Database etc. The experimental genotyping test-system was tested using 116 clinical samples with confirmed rotavirus infection and 14 biosamples negative for group A rotavirus RNA. Selective sequencing of VP7, VP6, VP4 gene marker loci was carried out as a reference method for verifying determination of rotavirus genotype. Results. Specific interaction between primers and DNA probes with genotype-specific loci of retrovirus genome segments and a lack of false-negative signals, complete match of genotyping results obtained by MR RT-PCR and sequencing methods were established. Conclusion. The resolution of MP RT-PCR methods allows designing test-systems that can confidently identify rotavirus genotypes with effectiveness of 90% and above.

Цель. Оценить разрешающую способность и диагностическую ценность метода мультиплексной ПЦР в режиме реального времени (МП ПЦР-РВ) в качестве базисной платформы для создания тест-систем G/P генотипирования штаммов ротавирусов группы А. Материалы и методы. Конструирование праймеров и ДНК зондов для экспериментальной тест-системы на основе МП ПЦР-РВ проведено с помощью специализированных компьютерных программ на основе баз данных сиквенсов GenBank NCBI, EMBL Nucleotide Sequence Database и др. Экспериментальная тест-система генотипирования испытана на 116 клинических образцах с подтвержденной ротаврусной инфекцией и 14 биопробах, негативных по РНК ротавирусов группы А. В качестве референс-метода для проверочного определения генотипа ротавирусов в исследуемых образцах использовано выборочное секвенирование маркерных локусов генов VP7, VP6, VP4. Результаты. Установлено специфическое взаимодействие праймеров и ДНК зондов с генотип-специфическими локусами сегментов ротавирусных геномов и отсутствие ложноположительных сигналов, полное совпадение результатов генотипирования полученных методом МП ПЦР-РВ и секвенированием. Заключение. Разрешающая способность метода МП ПЦР-РВ позволяет проектировать на его основе тест-системы, способные уверенно идентифицировать генотипы ротавирусов с эффективностью 90% и выше.

group A rotavirusesgenotypingmultiplex RT-PCRротавирусы группы Агенотипированиемультиплексная ПЦР-РВАнтонова О.С., Рудницкая Г.Е., Тупик А.Н., Буляница А.Л., Евстрапов А.А., Курочкин В.Е. Полимеразная цепная реакция: приборная и методическая реализация. Обзор аналитических характеристик. Научное приборостроение. 2011, 4: 5-21.Бениова С.Н., Жидков Е.М. Клинико-патогенетические особенности течения нозокомиальной ротавирусной инфекции. Дальневосточный медицинский журнал. 2007, 4: 15-17.Основные направления профилактики инфекционных и паразитарных заболеваний. М., Икар, 2012.Горбунова М.Г., Жираковская Е.В., Тикунова Н.В., Стасенко В.Л., Вайтович М.А., Тикунов А.Ю., Миленина В.М., Логиновских Н.В. Характеристика эпидемиологического процесса ротавирусной инфекции на территории Омской области в 1993-2007 годах. Сибирский медицинский журнал. 2008, 7: 113-116.Епифанова Н.В., Луковникова Л.Б., Голицына Л.Н., Фомина С.Г., Зверев В.В., Пономарева Н.В., Парфенова О.В., Новиков Д.В., Волкова М.А., Новикова Н.А. Этиологическая структура вирусных кишечных инфекций у детей в Нижнем Новгороде. Медицинский альманах. 2010, 2 (11): 233236.Мефодьев В.В., Устюжанин Ю.В., Козлов Л.Б., Фольмер А.Я. Эпидемиология и профилактика ассоциированных с водой кишечных антропонозов. Тюмень, 2006.Новикова Н.А., Федорова О.Ф., Епифанова Н.В., Чупрова А.Б. G[P] типы ротавируса группы А человека и их распространение в г. Нижнем Новгороде и г. Дзержинске в период 1997-2005 гг. Вопросы вирусологии. 2007, 3: 19-23.Подколзин А.Т, Мухина А.А., Шипулин ГА., Кузьмина В.Н., Браславская С.И., Малеев В.В., Горелов А.В., Белова Н.В., Боковой А.Г., Танина Н.Б., Новокшонов А.А., Соколова Н.В., Мазанкова Л.Н., Ильина Н.О., Шишкина С.В., Яковлева Г.Ю. Изучение этиологии острых кишечных инфекций у детей, госпитализированных в инфекционные отделения стационаров Москвы. Инфекц. болезни. 2004, 2: 85-91.Подколзин А.Т, Фенске Е.Б., Абрамычева Н.Ю., Шипулин Г.А., Дорошина Е.А., Козина Г.А., Сагалова О.И., Мазепа В.Н., Иванова Г.И., Семена А.В., Тагирова З.Г., Иванова В.В. , Молочный В.П., Иволгина А.В., Малеев В.В., Покровский В.И. Молекулярная диагностика-2007. М., 2007.Leung A.K., Kellner J.D. Rotavirus gastroenteritis, Advances in Therapy. 2005, 22 (5): 476-487.Steyer A., Poljsak-Prijatelj M., Barlic-Maganja D., Marin J. Human, porcine and bovine rotaviruses in Slovenia: evidence of interspecies transmission and genome reassortment. J. General Virology. 2008, 89: 1690-1698.Bresee J. S., Glass R. I., Ivanoff B., Gentsch J. R. Current status and future priorities for rotavirus vaccine development, evaluation and implementation in developing countries. Vaccine. 1999, 17: 2207-2222.Dennehy P.H. Transmission of rotavirus and other enteric pathogens in the home. Pediatr. Infect. Dis. J. 2000, 19 (10; l): S103-105.Gentsch J.R., Laird A.R., Bielfelt B. et al. Serotype diversity and reassortment between human and animal rotavirus strains: implications for rotavirus vaccine programs. J. Infect. Dis. 2005, 192: 146159.Glass R.I., Gentsch J., Smith J.C. Rotavirus vaccines: success by reassortment? Science. 1994. 265: 1389-1391.Global rotavirus information and surveillance bulletin. WHO, October 2012.Kapikian A.Z., Hoshino Y., Chanock R.M. Rotaviruses. In: Fields Virology. Knipe D., Howley P., Griffin D. et al. (ed.). Lippincott, Williams and Wi, Philadelphia, PA, USA, 2001, р. 1787-1833.Kosek M., Bern C., Guerrant R.L. The global burden of diarrhoeal disease, as estimated from studies published between 1992 and 2000. Bull. WHO. 2003, 81:197-204.Li W., Manktelow E., Kirchbach J. C. et al. Genomic analysis of codon, sequence and structural conservation with selective biochemical-structure mapping reveals highly conserved and dynamic structures in rotavirus RNAs with potential cis-acting functions. Nucl. Acids Res. 2010, 21: 7718-7735.Manual of rotavirus detection and characterization methods. WHO, October 2009.Martella V., Terio V., Arista S. et al. Nucleotide variation in the VP7 gene affects PCR genotyping of G9 rotaviruses identified in Italy. J. Med. Virol. 2004, 72: 143-148.Matthijnssens J., Ciarlet M., Rahman M. et al. Recommendations for the classification of group A rotaviruses using all 11 genomic RNA segments. Arch.Virol. 2008, 153 (8): 1621-1629.Natarajan G., Johnson Y.R., Zhang F. et al. Real-time polymerase chain reaction for the rapid detection of group B streptococcal colonization in neonates. Pediatrics. 2006, 1: 14-22.Parashar U. D., Gibson C. J., Bresee J. S., Glass R. I. Rotavirus and severe childhood diarrhea. Emerg. Infect. 2006, 12: 304-306.Patton J.T Rotavirus diversity and evolution in the post-vaccine world. Article Published in the Author Account of http://www.discoverymedicine.com/John-T-Patton/2012.