Journal of microbiology, epidemiology and immunobiologyJournal of microbiology, epidemiology and immunobiologyЖурнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии0372-93112686-7613Central Research Institute for Epidemiology13895ArticlesСтатьиResearch ArticleNEW APPROACHES TO DETECTION OF LEGIONELLOSIS CAUSATIVE AGENTS IN CLINICAL SAMPLES AND ENVIRONMENT OBJECTS BY PCRНОВЫЕ ПОДХОДЫ К ВЫЯВЛЕНИЮ ВОЗБУДИТЕЛЯ ЛЕГИОНЕЛЛЕЗА В КЛИНИЧЕСКИХ ОБРАЗЦАХ И ОБЪЕКТАХ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ МЕТОДОМ ПЦРPortenkoS. AПортенкоС. АOsinaN. AОсинаН. АBugorkovaT. VБугорковаТ. ВKutyrevV. VКутыревВ. ВRussian Research Institute of Plague Control «Microb», Saratov, RussiaРоссийский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов15122013906NO6 (2013)№6 (2013)949909062023Copyright ©; 2013, Portenko S.A., Osina N.A., Bugorkova T.V., Kutyrev V.V.Copyright ©; 2013, Портенко С.А., Осина Н.А., Бугоркова Т.В., Кутырев В.В.2013Portenko S.A., Osina N.A., Bugorkova T.V., Kutyrev V.V.Портенко С.А., Осина Н.А., Бугоркова Т.В., Кутырев В.В.https://creativecommons.org/licenses/by/4.0https://microbiol.crie.ru/jour/article/view/13895

Aim. Selection of perspective targets as a base for development of test systems for the detection of legionella DNA in study material by PCR with electrophoresis and hybridization-fluorescent accounting of the results. Materials and methods. 22 Legionella pneumophila, 3 Legionella spp. strains and 30 cultures of heterologic microorganisms, clinical material and environmental object samples were used in the study. Genome analysis was carried out by using Mega 3.1 program. Primer selection was conducted by using Primer Express program and BLAST algorithm and TaqMan format probes on the website www.genscript.com. Results. Analysis of 712 legionella nucleotide sequences for the presence of novel species-specific and conservative for L. pneumophila loci was carried out. Fragments of life-support genes were selected for the analysis: fliC, mompS, ftsZ, dotA, dnaX, trpS, rpoB, rnp, proA, gspA. The most perspective DNA targets were established to be ftsZ and mompS genes. Based on the selected loci, PCR test systems were constructed for the detection of DNA of legionella causative agent in biological material and environment objects, their diagnostic value was characterized. Conclusion. The studies carried out have shown the perspective of use of life-support ftsZ and mompS genes for the construction of novel preparations for legionellosis genetic diagnostics.

Цель. Подбор перспективных мишеней для разработки на их основе тест-систем для выявления ДНК легионелл в исследуемом материале в ПЦР с электрофоретическим и гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов. Материалы и методы. В исследованиях использовали 22 штамма Legionella pneumophila, 3 штамма Legionella spp. и 30 культур гетерологичных микроорганизмов; клинический материал и пробы из объектов окружающей среды. Анализ геномов проводили с использованием программы Mega 3.1.Подбор праймеров осуществляли с помощью программы Primer Express и алгоритма BLAST и зондов формата TaqMan на сайте www.genscript.com. Результаты. Проведен анализ 712 нуклеотидных последовательностей легионелл на наличие новых видоспецифичных и консервативных для L. pneumophila локусов. Для анализа были выбраны фрагменты генов жизнеобеспечения: fliC, mompS, ftsZ, dotA, dnaX, trpS, rpoB, rnp, proA, gspA. Установлено, что наиболее перспективными ДНК-мишенями являются гены ftsZ и mompS. На основе выбранных локусов сконструированы ПЦР тест-системы для выявления ДНК возбудителя легионеллеза в биологическом материале и объектах окружающей среды, охарактеризована их диагностическая ценность. Заключение. Проведенные исследования показали перспективность использования генов жизнеобеспечения ftsZ и mompS для конструирования новых препаратов для генной диагностики легионеллеза.

legionellosisnucleotide sequencesPCRлегионеллезнуклеотидные последовательностиПЦРКарбышев Г.Л., Терентьев А.Н., Веркина Л.М. и др. Конструирование препаратов для серологической диагностики легионеллеза. Конструирование и экспериментальные исследования легионеллезного серогруппы 1 антигенного полимерного диагностикума. Проблемы ООИ. 2006, 92: 52-54.Карпова Т.И., Дронина Ю.Е., Тартаковский И.С. и др. Природные биопленки легионелл и их роль в эпидемиологии инфекции: методы изучения и моделирования. Журн. микробиол. 2008, 2: 13-16.Онищенко Г.Г., Лазикова Г.Ф., Чистякова Г.Г. и др. Эпидемиологические версии расследования вспышки легионеллеза в г. Верхняя Пышма. Журн. микробиол. 2008, 2: 77-82.Тартаковский И.С. Болезнь легионеров: итоги 25-летнего изучения инфекции, проблемы и перспективы исследования. Вест. РАМН. 2001, 11: 11-14.Темежникова Н.Д. Лабораторная диагностика легионеллеза. Клин. лаб. диагн. 2008, 11: 34 39.Федоров Ю.Н., Янов Д.С., Кибирев Я.А. и др. Современные технологии в диагностике особо опасных инфекционных болезней. Саратов, 2003: 184-185.Castilla J., Barricarte A., Aldaz J. et al. A large Legionnaires' disease outbreak in Pamplona, Spain: early detection, rapid control and no case fatality. Epidemiol. Infect. 2007, 30: 1-10.Cloud J.L., Carrol K.C., Pixton P. et al. Detection of Legionella species in respiratory specimens using PCR with sequencing confirmation. J. Clin. Microbiol. 2000, 38 (5): 1709-1712.Diederen B.M., Peeters M.F Evaluation of two new immunochromatographic assays (Rapid U Legionella antigen test and SD Bioline Legionella antigen test) for detection of Legionella pneumophila serogroup 1 antigen in urine. J. Clin. Microbiol. 2006, 44 (8): 2991-2993.Fields B.S., Benson R.F, Besser R.E. Legionella and legionnaires'disease: 25 years of investigation. din. Microbiol. Rev. 2002, 15: 506-526.Koide M., Haranaga S., Higa F et al. Comparative evaluation of Duopath Legionella lateral flow assay against the conventional culture method using Legionella pneumophila and Legionella anisa strains. Jpn. J. Infect. Dis. 2007, 60 (4): 214-216.Wilson D.A., Yen-Lieberman B., Reischl U. et al. Detection ofLegionella pneumophila by real-time PCR for the mip gene. J. Clin. Microbiol. 2003, 41 (7): 3327-3330.Yzerman E.P., den Boer J.W, Lettinga K.D. et al. Sensitivity of three serum antibody tests in a large outbreak of Legionnaires' disease in the Netherlands. J. Med. Microbiol. 2006, 55 (5): 561-566.