Journal of microbiology, epidemiology and immunobiologyJournal of microbiology, epidemiology and immunobiologyЖурнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии0372-93112686-7613Central Research Institute for Epidemiology13480ArticlesСтатьиResearch ArticlePRODUCTION OF 70 KDA RECOMBINANT HUMAN HEAT SHOCK PROTEIN IN BACULOVIRUS EXPRESSION SYSTEM AND ASSESSMENT OF ITS ANTIVIRAL ACTIVITYПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА ТЕПЛОВОГО ШОКА 70 КДА ЧЕЛОВЕКА В БАКУЛОВИРУСНОЙ СИСТЕМЕ ЭКСПРЕССИИ И ОЦЕНКА ЕГО ПРОТИВОВИРУСНОЙ АКТИВНОСТИMerkulovV. AМеркуловВ. АPlekhanovaT. MПлехановаТ. МZverevA. YuЗверевА. ЮKarpovV. LКарповВ. ЛEvgenyevM. BЕвгеньевМ. БKadykovaO. NКадыковаО. НGordeevE. VГордеевЕ. ВPetrovA. AПетровА. АKovtunA. LКовтунА. ЛMakhlaiA. AМахлайА. АMironovA. NМироновА. НBranch of 48th Central Research Institute of Ministry of Defense of Russian Federation — Center of Virology, Sergiev PosadФилиал 48 ЦНИИ МО РФ — Вирусологический центр, Сергиев ПосадEngelgart Institute of Molecular Biology, Moscow, RussiaИнститут молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта, Москва15022011881NO1 (2011)№1 (2011)546009062023Copyright ©; 2011, Merkulov V.A., Plekhanova T.M., Zverev A.Y., Karpov V.L., Evgenyev M.B., Kadykova O.N., Gordeev E.V., Petrov A.A., Kovtun A.L., Makhlai A.A., Mironov A.N.Copyright ©; 2011, Меркулов В.А., Плеханова Т.М., Зверев А.Ю., Карпов В.Л., Евгеньев М.Б., Кадыкова О.Н., Гордеев Е.В., Петров А.А., Ковтун А.Л., Махлай А.А., Миронов А.Н.2011Merkulov V.A., Plekhanova T.M., Zverev A.Y., Karpov V.L., Evgenyev M.B., Kadykova O.N., Gordeev E.V., Petrov A.A., Kovtun A.L., Makhlai A.A., Mironov A.N.Меркулов В.А., Плеханова Т.М., Зверев А.Ю., Карпов В.Л., Евгеньев М.Б., Кадыкова О.Н., Гордеев Е.В., Петров А.А., Ковтун А.Л., Махлай А.А., Миронов А.Н.https://creativecommons.org/licenses/by/4.0https://microbiol.crie.ru/jour/article/view/13480

Aim. To obtain human recombinant 70kDa heat shock protein (Hsp70) in baculovirus expression system and to study its antiviral activity. Materials and methods. Baculovirus expression system was used to obtain recombinant HSP70. Plasmid pFastBacHTb-Hsp70 containing sequence coding HSP70 gene with insertion of 6 histidine residues in protein reading frame was constructed. Competent cells MAX Efficiency DH 10 Bac were transfected with pFastBacHTb-Hsp70 plasmid with following extraction of recombinant bacmid Bac-Hsp70. In order to obtain baculovirus expressing HSP70, Sf-9 cells were transfected with Bac-Hsp70 bacmid. Hsp70 extraction and purification was performed with column metal-chelating affinity chromatography using Ni 2+ ions. Protective efficacy of recombinant human HSP70 was estimated using model of Venezuelan equine encephalitis (VEE) in mice. Results. Recombinant bacmid Bac-Hsp70 was constructed based on Bac-to-Bac expression system. Baculovirus expressing human HSP70 have been produced after transfection of Sf-9 cells with Bac-Hsp70 bacmid. Cultivation of recombinant baculovirus in Sf-9 cells and application of metal-chelating affinity chromatography allowed to extract purified fraction of HSP70. Experiments on mice infected with VEE virus demonstrated significant protection from death after administration of HSP70 in dose 15 mcg/mice. Conclusion. Application of baculovirus expression system and insect cell line for accumulation of recombinant baculoviruses in combination with Ni 2+-mediated metal-chelating affinity chromatography allowed to obtain highly purified human recombinant HSP70 with marked antiviral activity.

Цель. Получение рекомбинантного белка теплового шока 70 кДа (БТШ70) человека в бакуловирусной системе экспрессии и оценка его противовирусной активности. Материалы и методы. Для получения рекомбинантного БТШ70 использовалась бакуловирусная система экспрессии. Сконструирована плазмида pFastBacHTb-Hsp70, у которой в рамку считывания гена БТШ70 введена последовательность, кодирующая 6 гистидиновых остатков. pFastBacHTb-Hsp70 трансформировали компетентные клетки МАХ Efficiency DH 10 Bac и выделяли рекомбинантную бакмиду Bac-Нsp70. Для получения бакуловируса, экспрессирующего БТШ70, Bac-Нsp70 трансфицировали клетки Sf-9. Выделение и очистку БТШ70 проводили методом аффинной металл-хелатной колоночной хроматографии с использованием ионов Ni 2+. Защитную эффективность рекомбинантного БТШ70 человека оценивали в отношении инфекции ВЭЛ у мышей. Результаты. На основе бакуловирусной системы экспрессии Bac-to-Bac сконструирована рекомбинантная бакмида Bac-Нsp70. При трансфекции Bac-Нsp70 клеток Sf-9 получен бакуловирус, экспрессирующий БТШ70 человека. Культивирование рекомбинантного бакуловируса в клетках Sf-9 и применение метода аффинной металл-хелатной хроматографии позволило выделить очищенный препарат БТШ70. В опытах на мышах, инфицированных вирусом ВЭЛ, выявлен достоверный уровень их защиты от гибели при введении БТШ70 в дозе 15,0 мкг/мышь. Заключение. Использование бакуловирусной системы экспрессии белков, линии клеток насекомых Sf-9 для накопления рекомбинантных бакуловирусов и метода аффинной металл-хелатной хроматографии с применением ионов Ni 2 + позволяет получить высокоочищенный рекомбинантный БТШ70 человека, обладающий выраженной противовирусной активностью.

70 kDa recombinant heat shock proteinbaculovirus expression systemSf-9 cell linemetal-chelating affinity chromatographyVenezuelan equine encephalitis (VEE) virusmiceрекомбинантный белок теплового шока 70 кДабакуловирусная система экспрессиилиния клеток SF-9аффинная металл-хелатная хроматографияэкспериментальная инфекция ВЭЛмышиАшмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л., 1962.Гужова И.В. Механизмы работы шаперона Hsp70 в нормальных клетках и при клеточной патологии. Автореф. дис. д-ра биол. наук. СПб, 2004.Пастухов Ю.Ф., Екимова И.В. Молекулярные, клеточные и системные механизмы протективной функции белка теплового шока 70 кДа. Мол. клет. нейробиол. 2005, 2: 3-25.Махлай А.А., Ковтун А.Л., Марков В.И. и др. Способ биопротекции, основанный на использовании препарата БТШ70, предназначенный для создания средств и методов неспецифической защиты от опасных биологических поражающих факторов. Патент РФ № 2263144, зарег. в ГРИ РФ 27.10.05 г.Пшеничнов В.А., Семенов Б.Ф., Зезеров Е.Г. Стандартизация методов вирусологических исследований. М., Медицина, 1974.Шевчик Ю.С., Курбатова Е.А., Свешников П.Г. и др. Рекомбинантный белок теплового шока (rHSP70) усиливает активацию врожденного и адаптивного иммунитета при совместном введении с бактериальными антигенами в эксперименте. Журн. микробиол. 2009, 1: 42-46.Asea A. Mechanisms of HSP72 release. J. Biosci. 2007, 32: 579-584.Giffard R.G., Xu L., Zhao H. et al. Chaperons, protein aggregation, and brain protection from hypoxic/ischemic injury. J. Exper. Biol. 2004, 207: 3213-3220.Hauser H., Shen L., Gu Q.L. et al. Secretory heat-shock protein as a dendritic cell-targeting molecule: a new strategy to enhance the potency of genetic vaccines. Gene Ther. 2004, 11 (11): 924-932.Hochuli E., Dobeli H., Schacher A. New metal chelate adsorbent selective for proteins and peptides containing neighbouring histidine residues. J. Chromatography. 1987, 411: 177-184.Langereis M.A., Rosas-Acosta G., Mulder K., Wilson Van G. Production of sumoylated proteins using a baculovirus expression system. J. Virol. Meth. 2007, 139 (2): 189-194.McCall E.G., Danielsson A., Ian M. Hardern I.M. et al. Improvements to the throughput of recombinant protein expression in the baculovirus/insect cell system. Protein Expres. Pur. 2005, 42: 29-36.Rokutan K. Molecular chaperone inducers in medicine and diseases. Nippon Yakurigaku Zassi. 2003, 121 (1): 15-20.Srivastava P. Roles of heat-shock proteins in innate and adaptive immunity. Nat. Rev. 2002, 2: 185-194.