Journal of microbiology, epidemiology and immunobiologyJournal of microbiology, epidemiology and immunobiologyЖурнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии0372-93112686-7613Central Research Institute for Epidemiology13353ArticlesСтатьиResearch ArticleIDENTIFICATION AND CHARACTERIZATION OF NON-CULTIVATED FORMS OF ENTEROBACTERIA ERWINIA CAROTOVORA IN CONTINUOUSLY INCUBATED CULTURESВЫЯВЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА НЕКУЛЬТИВИРУЕМЫХ ФОРМ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ ERWINIA CAROTOVORA В ДЛИТЕЛЬНО ИНКУБИРУЕМЫХ КУЛЬТУРАХGogolevYu. VГоголевЮ. ВGorshkovV. YuГоршковВ. ЮPetrovaO. EПетроваО. ЕMukhametshinaN. EМухаметшинаН. ЕAgeevaM. VАгееваМ. ВKazan Institute of Biochemistry and Biophysics, RussiaКазанский институт биохимии и биофизики15082009864NO4 (2009)№4 (2009)778009062023Copyright ©; 2009, Gogolev Y.V., Gorshkov V.Y., Petrova O.E., Mukhametshina N.E., Ageeva M.V.Copyright ©; 2009, Гоголев Ю.В., Горшков В.Ю., Петрова О.Е., Мухаметшина Н.Е., Агеева М.В.2009Gogolev Y.V., Gorshkov V.Y., Petrova O.E., Mukhametshina N.E., Ageeva M.V.Гоголев Ю.В., Горшков В.Ю., Петрова О.Е., Мухаметшина Н.Е., Агеева М.В.https://creativecommons.org/licenses/by/4.0https://microbiol.crie.ru/jour/article/view/13353

Aim. To determine overall number as well as number of viable cells in continuously incubated cultures of E.carotovora by methods of confocal microscopy and quantitative PCR-analysis. Materials and methods. Strain E.carotov ora atroseptica SCRI1043 was grown on LB medium to density 2x10 9 CFU/ml. Cells were aggregated by centrifugation and transferred on fresh LB medium, containing alkyloxybenzol, or on the AB medium, which was deficient on phosphorus and carbon. BacLight LIVE/ DEAD kit in combination with confocal laser microscopy as well as quantitative PCR were used for the determination of the number of viable cells. Results. Total number and number of viable cells in cultures on AB medium was high (10 8 — 10 9 and 10 7 — 10 8 cells/ml respectively) up to 3—5 months of cultivation. Though, number of cultivated cells significantly decreased in all variants of the experiment. Number of viable cells in such cultures was several orders greater than genomic copies detected by PCR. Efficacy of DNA amplification increased after dialysis and deproteinization of samples. Conclusion. Loss of cultivation ability when number of viable bacteria is high points to possible switch of E.carotovora cells in non-cultivated state under unfavourable conditions. We assume that it is accompanied by formation of low-molecular components and DNAbound proteins in cells, which inhibit PCR.

Цель . Определение общего числа и числа жизнеспособных клеток в длительно инкубируемых культурах E.carotovora методами конфокальной микроскопии и количественного ПЦРанализа. Материалы и методы. Бактерии E.carotovora atroseptica SCRI1043 выращивали в среде LB до плотности 2х10 9 КОЕ/мл. Клетки собирали центрифугированием и переносили в свежую среду LB, содержащую алкилоксибензол, или среду АВ, дефицитную по фосфору и углероду. Для определения количества жизнеспособных клеток использовали набор BacLight LIVE/DEAD в сочетании с конфокальной лазерной микроскопией, а также количественную ПЦР. Результаты . Общее число и число жизнеспособных клеток в культурах на среде АВ оставалось высоким (10 8 — 10 9 и 10 7 — 10 8 кл./мл соответственно) до 3 — 5 месяцев. Однако количество культивируемых клеток значительно снижалось во всех вариантах опыта. Жизнеспособных клеток в таких культурах оказывалось на несколько порядков больше, чем геномных копий, выявляемых в ПЦР. Эффективность амплификации ДНК повышалась после диализа и депротеинизации образцов. Заключение . Потеря культиви- руемости при высоком количестве жизнеспособных клеток свидетельствует о возможности перехода клеток E.carotovora в некультивируемое состояние в неблагоприятных условиях. Мы предполагаем, что при этом в клетках образуются низкомолекулярные компоненты и ДНКсвязанные белки, ингибирующие ПЦР.

non-cultivated cells Erwinia carotovoraviable cellsPCR inhibitorsнекультивируемые клетки Erwinia carotovoraжизнеспособные клеткиингибиторы ПЦРБухарин О.В., Литвин В.Ю. Патогенные бактерии в природных экосистемах. Екатеринбург, УрО РАН, 1997.Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. Молекулярное клонирование. М., Мир. 1984.Мулюкин А.Л., Сузина Н.Е., Дуда В.И. Структурное и физиологическое разнообразие цистоподобных покоящихся клеток бактерий рода Pseudomonas. Микробиология. 2008, 77 (4): 512-523.Чернов В.М., Мухаметшина Н.Е., Гоголев Ю.В. Адаптация микоплазм к неблагоприятным условиям роста: нанотрансформация и фитопатогенность. ДАН. 2007, 413: 1-5.Эль-Регистан Г.И., Мулюкин А.Л., Николаев Ю.А. Адаптогенные функции внеклеточных ауторегуляторов микроорганизмов. Микробиология. 2006, 75 (4): 446-456.Bell K.S., Sebaihia M., Pritchard L. Genome sequence of the enterobacterial phytopathogen Erwinia carotovora subsp. atroseptica and characterization of virulence factors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004, 101 (30): 11105-11110.Bogosian G., Bourneuf E.V. A matter of bacterial life and death. EMBO Rep. 2001, 2 (9): 770-774.Lee J.L., Levin R.E. Use of ethidium bromide monoazide for quantification of viable and dead mixed bacterial flora from fish fillets by polymerase chain reaction. J. Microbiol. Meth. 2006, 67 (3): 456-462.Oliver J.D. The viable but nonculturable state in bacteria. J. Microbiol. 2005, 43: 93–100.Ordax M., Marco-Noales E., López M.M. Survival strategy of Erwinia amylovora against copper: induction of the viable-but-nonculturable state. Appl. Environ. Microbiol. 2006, 72 (5): 3482-3488.Smith B., Oliver J.D. In situ and in vitro gene expression by Vibrio vulnificus during entry into, persistence within, and resuscitation from the viable but non-culturable state. Ibid., 72 (2): 1445-1451.