Journal of microbiology, epidemiology and immunobiologyJournal of microbiology, epidemiology and immunobiologyЖурнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии0372-93112686-7613Central Research Institute for Epidemiology100210.36233/0372-9311-28ORIGINAL RESEARCHESОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯUnknownInfluence of immunomodulation on intracellular cytokine expression by spleen T-helpers of mice immunized by Yersinia pestis EV NIIEGВлияние иммуномодуляции на внутриклеточную экспрессию цитокинов Т-хелперами селезёнки мышей, иммунизированных Yersinia pestis ЕV НИИЭГhttps://orcid.org/0000-0002-5550-6063KlyuevaS. N.КлюеваС. Н.
Russian Federation

Svetlana N. Klyueva — Cand. Sci. (Biol.), researcher, Department of immunology 

Saratov

Клюева Светлана Николаевна — кандидат биологических наук, научный сотрудник отделения иммунологии

 Саратов

klyueva.cvetlana@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0002-9994-7936GoncharovaA. Yu.ГончароваА. Ю.
Russian Federation

Anastasiya Yu. Goncharova — Cand. Sci. (Med.), researcher, Department of immunology 

Saratov

Гончарова Анастасия Юрьевна — кандидат медицинских наук, научный сотрудник отделения 

Саратов

https://orcid.org/0000-0002-9016-6578KravtsovA. L.КравцовА. Л.
Russian Federation

Aleksandr L. Kravtsov — Cand. Sci. (Biol.), leading researcher, Department of immunology 

Saratov

Кравцов Александр Леонидович — доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник отделения иммунологии

 Саратов

https://orcid.org/0000-0001-7548-4845BugorkovaS. A.БугорковаС. А.
Russian Federation

Svetlana A. Bugorkova — D. Sci. (Med.), deputy head, Department of immunology 

Saratov

Бугоркова Светлана Александровна — доктор медицинских наук, исполняющая обязанности заведующего отделения иммунологии

Саратов

Russian Research Anti-Plague Institute «Microbe»Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»050520219821561622203202122032021Copyright ©; 2021, Klyueva S.N., Goncharova A.Y., Kravtsov A.L., Bugorkova S.A.Copyright ©; 2021, Клюева С.Н., Гончарова А.Ю., Кравцов А.Л., Бугоркова С.А.2021Klyueva S.N., Goncharova A.Y., Kravtsov A.L., Bugorkova S.A.Клюева С.Н., Гончарова А.Ю., Кравцов А.Л., Бугоркова С.А.https://creativecommons.org/licenses/by/4.0https://microbiol.crie.ru/jour/article/view/1002

Aim. To characterize the intracellular expression of cytokines by spleen T-helpers and the spontaneous production of cytokines in the blood of BALB/c mice immunized with Yersinia pestis EV NIIEG against the background of immunomodulation.

Materials and methods. Intracellular expression of CD4+IFN-γ+, CD4+IL-4+, CD4+IL-17+ was determined in mice spleen cell suspensions by flow cytometry, IFN-γ and IL-10 were measured in ELISA in blood supernatants on day 3 and day 21 after the immunization with Y. pestis EV against the background of immunomodulation. On day 21 after the immunization animals were infected by Y. pestis 231 at a dose of 400 LD50.

Results. Differences in cytokine response to studied drugs, correlated with CD4+IFN-γ+ levels in animals, were identified. On day 3, a significant decrease in CD4+IFN-γ+ was observed in response to Y. pestis EV and to recombinant gamma interferon (Ingaron). A significant increase in CD4+IFN-γ+ was detected in response to vaccine strain administered with azoximer bromide (Polyoxidonium). Intracellular expression of IFN-γ, IL-4 and IL-17 increased on day 21by an average of 2,3 times when immunomodulators were used in the immunization schedule. In addition, on day 21 a significant (p ˂ 0.05) increase in the proportion of T-helpers expressing IFN-γ, as well as in level of spontaneous IFN-γ production in blood supernatants was observed only in animals immunized by schedules that included immunomodulators. After the challenge with Y. pestis 231 of animals previously immunized by schedules that included Polyoxidonium, the correlation analysis confirmed the association (r = 0,94; p = 0,0004) of mice survival with intensity of CD4+IFN-γ+ expression.

Conclusion. The data obtained confirm the effectiveness of Polyoxidonium application in experimental animal Y. pestis EV immunization schedule and the usefulness of intracellular cytokine expression measurement for assessment of the level of protection following the immunization.

Цель работы — охарактеризовать внутриклеточную экспрессию цитокинов Т-хелперами селезенки и спонтанную продукцию цитокинов в крови мышей линии BALB/c, иммунизированных Yersinia pestis ЕV НИИЭГ на фоне иммуномодуляции.

Материалы и методы. Внутриклеточную экспрессию CD4+IFN-γ+, CD4+IL-4+, CD4+IL-17+ определяли в суспензии клеток селезенки мышей методом проточной цитометрии, а IFN-γ и IL-10 — в супернатантах крови методом иммуноферментного анализа на 3-и и 21-е сутки после иммунизации Y. pestis ЕV НИИЭГ на фоне иммуномодуляции. Заражение животных Y. pestis 231 в дозе 400 LD50 проводили на 21-е сутки после иммунизации.

Результаты. Выявлены различия в цитокиновом ответе при введении исследуемых препаратов, коррелирующие с уровнем CD4+IFN-γ+ у животных. Так, на 3-и сутки установлено достоверное снижение CD4+IFN-γ+ при введении Y. pestis EV НИИЭГ и препарата рекомбинантного γ-интерферона (ингарон). В ответ на применение вакцинного штамма с азоксимером бромида (полиоксидоний) регистрировали значимое повышение CD4+IFN-γ+. На 21-е сутки внутриклеточная экспрессия всех исследуемых цитокинов IFN-γ, IL-4 и IL-17 увеличивалась в среднем в 2,3 раза при использовании иммуномодуляторов в схеме иммунизации. Кроме того, на 21-е сутки регистрировали достоверное (p ˂ 0,05) увеличение доли Т-хелперов, экспрессирующих IFN-γ, а также уровня спонтанной продукции IFN-γ в супернатантах крови только у животных, иммунизированных с применением схем, включающих иммуномодуляторы. При заражении Y. pestis 231 животных, предварительно иммунизированных в сочетании с полиоксидонием, методом корреляционного анализа подтверждена связь (r = 0,94; р = 0,0004) выживаемости мышей c интенсивностью экспрессии CD4+IFN-γ+.

Заключение. Полученные данные подтверждают эффективность применения полиоксидония в схемах иммунизации экспериментальных животных Y. pestis EV НИИЭГ и информативность оценки степени протекции, создаваемой иммунизацией, по результатам внутриклеточной экспрессии цитокинов.

Yersinia pestisazoximer bromiderecombinant gamma interferonT-helper cellscytokinesflow cytometryYersinia pestisазоксимера бромидрекомбинантный интерферон-гаммаТ-хелперыцитокиныпроточная цитометрияThe study was supported by budget funding within the framework of the research topic No АААА-А16-118011590103-АИсследование выполнено при поддержке бюджетного финансирования в рамках темы НИР № АААА-А16-118011590103-А1. Verma S.K., Tuteja U. Plague vaccine development: current research and future trends. Front. Immunol. 2016; 7: 602. https://doi.org/10.3389/fimmu.2016.006022. Омельченко Н.Д., Иванова И.А., Беспалова И.А., Филиппенко А.В. Иммуномодуляторы и специфическая профилактика инфекционных болезней. Проблемы особо опасных инфекций. 2017; (3): 21–6. https://doi.org/10.21055/0370-1069-2017-3-21-23. Бугоркова С.А., Курылина А.Ф., Щуковская Т.Н. Морфофункциональная характеристика иммунокомпетентных органов мышей линии Balb/c при иммунизации вакцинным штаммом Yersinia pestis EV НИИЭГ на фоне иммуномодуляции. Проблемы особо опасных инфекций. 2017; (2): 58–62. https://doi.org/10.21055/0370-1069-2017-2-58-624. Кравцов А.Л., Курылина А.Ф., Клюева С.Н., Щуковская Т.Н. Модулирующий эффект полиоксидония на реактивность клеток иммунной системы при формировании противочумного иммунитета. Иммунология. 2016; 37(6): 320–5. https://doi.org/10.18821/0206-4952-2016-37-6-320-3255. Пономарева Т.С., Дерябин П.Н., Каральник Б.В., Тугамбаев Т.И., Атшабар Б.Б., Денисова Т.Г. и др. Влияние полиоксидония на иммуногенную и протективную активность живой чумной вакцины. Иммунология. 2014; 35(5): 286–90.6. Щуковская Т.Н., Курылина А.Ф., Шавина Н.Ю., Бугоркова С.А. Влияние полиоксидония, Poly(I:C), даларгина на защитное действие вакцинного штамма Yersinia pestis EV НИИЭГ при экспериментальной чуме. Российский иммунологический журнал. 2020; 23(1): 41–50. https://doi.org/10.15789/1028-7221-005-IOP7. Костарева О.С., Габдулхаков А.Г., Коляденко И.А., Гарбер М.Б., Тищенко С.В. Интерлейкин-17: функциональные и структурные особенности; использование в качестве терапевтической мишени. Успехи биологической химии. 2019; 59: 393–418.8. Клюева С.Н., Кравцов А.Л., Бугоркова С.А., Щуковская Т.Н., Кожевников В.А., Гончарова А.Ю. Фагоцитарная и цитокин-продуцирующая активность лейкоцитов крови мышей линии Balb/c, привитых против чумы на фоне иммуномодуляции полиоксидонием. Российский иммунологический журнал. 2019; 13(4): 1412–20. https://doi.org/10.31857/S102872210007044-39. Parent M.A., Wilhelm L.B., Kummer L.W., Szaba F.M., Mullarky I.K., Smiley S.T. Gamma interferon, tumor necrosis factor alpha, and nitric oxide synthase 2, key elements of cellular immunity, perform critical protective functions during humoral defense against lethal pulmonary Yersinia pestis infection. Infect. Immun. 2006; 74(6): 3381–6. https://doi.org/10.1128/iai.00185-0610. Smith S.G., Smits K., Joosten S.A., Meijgaarden K.E., Satti I., Fletcher H.A., et al. Intracellular cytokine staining and flow cytometry: Considerations for application in clinical trials of novel tuberculosis vaccines. PLoS One. 2015; 10(9): e0138042. https://doi.org/10.1371/journal.pone.013804211. Flaxman A., Ewer K.J. Methods for measuring T-cell memory to vaccination: from mouse to man. Vaccines (Basel). 2018; 6(3): 43. https://doi.org/10.3390/vaccines603004312. Leal E.A., Moreira J.D., Nunes F.F., Souza L.R., Martins J.M., Toledo V.P.C., et al. Humoral and cellular immune response of mice challenged with Yersinia pestis antigenic preparations. Braz. J. Infect. Dis. 2017; 21(6): 620–6. https://doi.org/10.1016/j.bjid.2017.09.00113. Bi Y., Zhou J., Yang H., Wang X., Zhang X., Wang Q., et al. IL-17A produced by neutrophils protects against pneumonic plague through orchestrating IFN-γ-activated macrophage programming. J. Immunol. 2014; 192(2): 704–13. https://doi.org/10.4049/jimmunol.130168714. Бугоркова С.А., Щуковская Т.Н., Микшис Н.И., Клюева С.Н., Кудрявцева О.М., Кравцов А.Л. и др. Комплексное иммунологическое исследование вакцинированных живой чумной вакциной лиц, проживающих на территории Прикаспийского песчаного очага чумы в Республике Калмыкия. Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2018; 17(3): 38–49. https://doi.org/10.31631/2073-3046-2018-17-3-38-5015. Луцкий А.А., Жирков А.А., Лобзин Д.Ю., Рао М., Алексеева Л.А., Мейрер М. и др. Интерферон-γ: биологическая функция и значение для диагностики клеточного иммунного ответа. Журнал инфектологии. 2015; 7(4): 10–22. https://doi.org/10.22625/2072-6732-2015-7-4-10-22