Molecular reconstruction of the transmembrane coronavirus heterocomplex formed by the receptor S and the ionic channel E proteins

Full Text

Введение

Семейство коронавирусов образовано липидсодержащими вирусами, имеющими в качестве генома одноцепочечную РНК позитивной полярности [1, 2]. Вирионы состоят из двух модулей: внутреннего рибонуклеопротеида (РНП) и наружной липопротеидной оболочки. В состав РНП входит вирусная РНК (размером ~ 30 × 10³ нт), связанная с нуклеокапсидным белком N (молекулярная масса 60 кДа), который присутствует в количестве около 500 молекул на вирион. Наружную липидную оболочку формирует липидный бислой, в который изнутри встроен матриксный белок М (35 кДа), присутствующий в количестве ~ 1000 молекул/вирион [3, 4]. Два наружных белка: рецепторный гликопротеид S (150–170 кДа) и белок ионного канала Е (виропорин) (7,5 кДа) пронизывают насквозь липидную мембрану вириона (трансмембранные белки). Тример белка S образует около 30–60 шипов (~ 90–120 молекул) на поверхности вириона, а белок Е формирует трансмембранные олигомерные ионные каналы и присутствует в количестве 20–40 молекул на вирион [4–6]. Относительно мультимерной структуры ионного канала Е данные разнятся и указывают на возможность функционирования данного белка в форме ди-, три- и пентамеров [7–12]. В настоящее время считается, что гомотримеры белка S и мультимеры белка Е локализуются в вирусной липидной мембране автономно и не связаны друг с другом. Однако такие выводы сделаны главным образом на основании изучения вирусоспецифических синтетических пептидов и/или индивидуальных белков S и виропорина Е, полученных, как правило, с помощью генной инженерии и встроенных in vitro в искусственные липидные мембраны [13–18]. Вопрос о возможной структурной интеграции данных белков в составе вирионов остаётся открытым.

Для коронавирусов характерен феномен протеолитической активации вирусных частиц, который связан с точечным протеазным расщеплением поверхностного белка S0 (150–170 кДа) на два фрагмента — S1 и S2, молекулярная масса каждого ~ 80 кДа [19, 20]. Расщепление происходит в 2 сайтах по остаткам аргинина 680 и 810 (штамм Omicron) и осуществляется в первом случае — фурином в мембранах эндоплазматического ретикулума–аппарата Гольджи при сборке вируса в клетках, а во втором сайте — либо сериновой протеазой TMPRSS2 (на клеточной поверхности в плазматической мембране), либо цистеиновой протеазой катепсин L в составе внутриклеточных вакуолей при сборке вируса или при его входе в клетку-мишень [21–23]. Данные вариации механизма протеолитического расщепления белка S0 влияют на инфекционность вируса и заражение клеток различных органов в организме человека, что в значительной мере определяет контагиозность и патогенность штаммов бетакоронавируса человека [24–26].

В 2023 г. был создан аналитический инструмент компьютерного моделирования 3D-структуры белков и их белковых комплексов — программа AlphaFold, версия 3 (AlphaFold3) [27–29]. Алгоритмы указанной программы строились на двух основных принципах:

1) базовый семантический принцип, в котором белковые молекулы строились по аналогии с уже известными и систематизированными 3D-структурами белковых молекул обширной белковой базы (более 2 × 10⁸ белковых структур; база данных AlphaFold в EMBL-EBI¹), аминокислоты принимались за «слова», а структуры молекул и белковых комплексов квалифицировались в качестве «предложений» [27, 30].

2) второй принцип, дополняющий первый, был основан на анализе структурных взаимодействий отдельных участков (доменов) в исследуемых макромолекулярных белковых комплексах, таких как физико-химическая ориентация индивидуальных аминокислот и их атомов, совпадение поверхностей отдельных пептидных цепей и их аминокислот и т. п. [28, 29, 31, 32]. Такой инструмент предсказания структуры белковых комплексов на основе искусственного интеллекта широко используется в современных научных исследованиях инженерии ферментов, исследованиях заболеваний и разработке лекарств [33, 34]. Методология программы AlphaFold3, в отличие от прежних версий AlphaFold и AlphaFold2, позволяет более точно структурировать белок-белковые взаимодействия с участием мультидоменных белков [28, 33]. Работа программы базируется на анализе атомного облака молекул, его последовательного уточнения и последовательного сведения к наиболее точной 3D-структуре входящих молекул и совместимости их структур, а также интеграции и критического обмена (обучения) полученных данных с библиотекой баз данных PDB [33–36].

Для исследования возможности формирования комплексов белков S и Е коронавируса SARS-CoV-2 (семейство Coronaviridae, род Betacoronavirus) были предсказаны 3D-модели таких мультимерных гетерокомплексов (ГК) S–E с использованием алгоритма AlphaFold3. Точность предсказания программы AphaFold3 приближается к 90% [36, 37].

Цель работы — молекулярная реконструкция коронавирусного трансмембранного ГК рецепторного белка S и белка ионного канала Е.

Материалы и методы

Вирусы и аминокислотные последовательности вирусных белков

В исследовании анализировали первичные структуры белков S0, S1, S2 и Е бетакоронавируса SARS-CoV-2. Аминокислотные (АМК) последовательности брали из данных GenBank для S0 и Е белков бетакоронавируса человека (штамм Omicron ВА.5; ac.n. PZ213865). При получении фрагментов S1 и S2 рецепторного белка S0 принимали расщепление S0 (АМК: 14–1268) → S1 (АМК: 14–680) + S2 (АМК: 681–1268) в первом полиаргининовом (фурин-специфическом) сайте (S1/S2) расщепления по АМК аргинин в позиции 680: ...SPRRAR₆₈₀↓SVAS... [19, 38, 39].

Предсказание трёхмерных моделей комплексов белков

Для построения комплексов белковых макромолекул и исследования их структурных характеристик проводили модельную реконструкцию возможной структуры ГК S–E с помощью программы AlphaFold3 [27, 40]. Данная программа сконструирована на основе семантического алгоритма с учётом обширной базы экспериментальных моделей белковых молекул и белковых мультимерных структур и позволяет строить модели структур как индивидуальных белков, так и гетерологичных мультимолекулярных белковых комплексов [33–37, 41, 42]. В программе применяется спектр структурных метрик, которые характеризуют 3D-структуру реконструированных макромолекул (суммированы в табл. 1). В настоящем исследовании мультимолекулярных ГК белков бетакоронавируса S–E основное внимание уделяли следующим метрикам (табл. 1): показатель локальной достоверности близости для каждого остатка (pLDDT), показатели точности межмолекулярных интерфейсов субъединиц в комплексе (pTM и ipTM), фактор столкновения атомов (clash-score) и показатель достоверности всей модели, интегрирующий индивидуальные метрики (ranking score) [29, 36, 37, 42, 43]. Для построения вирусных белковых комплексов мы использовали первичную структуру белков S и E и реконструировали модели ГК данных белков для бетакоронавируса человека SARS-CoV-2. Исходными матрицами для построения 3D-структуры ГК S–E служили первичные структуры данных белков. С помощью программного приложения PyMOL оценивали межмолекулярные дистанции АМК в ГК и величины среднеквадратичного отклонения (Root Mean Square Deviation, RMSD), характеризующие отклонение между атомами в моделях белковой цепи до и после формирования ГК, которое определялось для каждого сравниваемого белка.

 

Таблица 1. Метрики, характеризующие предсказание 3D-структуры макромолекул в AlphaFold3

Метрики	Характеристика метрики	Шкала значений метрики	Публикации
pTM (Predicted template modeling score)	Оценка достоверности, расстояний между Cα-атомами аминокислот в одной белковой цепи, отражающая степень правильности предсказания 3D-структуры	Шкала от 0 до 1, где значения > 0,7 указывают на высокую достоверность общей топологии, а < 0,5 — на сниженную достоверность 3D-структуры	[43] www.ebi.ac.uk
ipTM (Interface predicted template modeling score)	Оценка достоверности, расстояний между атомами в интерфейсах белковых цепей, отражающая степень точности их стыковки в ГК	Шкала от 0 до 1, где значения > 0,8 указывают на высокую достоверность сборки белковых интерфейсов, а < 0,6 свидетельствуют о сниженной достоверности и наличию неточных построений	[43] www.ebi.ac.uk
pLDDT (Predicted local distance difference test)	Прогнозируемый тест локальной разности расстояний между каждым отдельным Cα-атомом и окружающими его в радиусе 15 Å атомами белка, показывающий степень локальной достоверности предсказанной 3D-структуры для каждого аминокислотного остатка	Шкала от 0 до 100, где значения > 90 означают максимальную точность на уровне боковых цепей, а < 50 указывают на гибкие, структурно неупорядоченные участки	[27] www.ebi.ac.uk
RMSD (Root Mean Square Deviation)	Величина среднеквадратичного отклонения координат атомов, отражающая степень близости их позиций в Å, в сравниваемых моделях реконструированных белковых цепей	Шкала от 0, где значение 0 Å указывает на абсолютное совпадение атомов структур; < 2,0 Å — на высокую точность совпадения геометрии; > 4,0 Å — на принципиальные структурные различия	[27]
Clash Score (Steric clash score)	Показатель, фиксирующий геометрические аномалии, при которых атомы в модели оказываются неестественно близко друг к другу или «взаимно пересекаются» в пространстве, нарушая законы физики	Шкала 0 или 1, где 0 означает отсутствие критических стерических наложений, 1 — наличие недопустимых столкновений атомов	[28] www.alphafoldserver.com
Fraction of disordered residues	Соотношение аминокислотных остатков с крайне низкими локальными баллами уверенности (pLDDT < 50) к общему числу остатков в макромолекуле, отражающая степень структурной гибкости и подвижности участков белка	Шкала от 0 до 100%, где значение показывает долю белка, не имеющую фиксированной трёхмерной структуры в изолированном состоянии	[28] www.alphafoldserver.com
Ranking score	Интегративная метрика коэффициентов точности интерфейсов (ipTM), общей укладки (pTM), доли неупорядоченных участков и вычета стерических столкновений, показывающая интегрированную достоверность ГК	Шкала от –100 до 1,5, где значения > 0,7 указывают на высокую суммарную достоверность структуры и интерфейсов комплекса и соответствуют наилучшему качеству предсказания, а отрицательные значения свидетельствуют о возможных ошибках в структуре модели	[28, 37] www.alphafoldserver.com

 

Инструментальное выполнение работы с программой и анализ межбелковых контактов

Реконструкция комплекса рецепторного белка S и белка ионного канала Е бетакоронавируса человека (штамм Omicron, субтип ВА.5) выполнена с помощью программы AlphaFold3. Первичные структуры в соответствующим количестве копий анализируемых белков вводили через веб-сервер AlphaFold Server со стандартными параметрами сервера, предусматривающими генерацию 5 альтернативных структур. Для дальнейшего анализа использовали приоритетную структуру с наилучшими структурными метриками, выбранную сервером на основе интегрального показателя достоверности ranking score (рассчитываемого на базе метрик pTM, ipTM, disorder fraction, clash score; табл. 1). Высокий показатель ranking score определяется по формуле: 0,8 × ipTM + 0,2 × pTM + 0,5 × disorder — 100 × has–clash [27] и указывает на версию модели высокого качества с высоким совпадением топологии и зон межмолекулярных контактов. С помощью программного обеспечения PyMOL оценивали расстояния между Cα-атомами (α-углеродами) в интерфейсе взаимодействия белков в ГК, а также величины RMSD, которые характеризуют пространственную близость атомов. Для более детального анализа была выбрана версия ГК 3S–3E с высоким рейтинговым баллом (0,79). Построение детальной сети контактов в финальных 3D-координатах проводили в среде PyMOL по расстояниям между взаимодействующими атомами со следующими геометрическими порогами:

• водородные связи: полярные контакты на расстоянии ≤ 3,8 Å;
• электростатические взаимодействия: контакты между противоположно заряжёнными атомами гетерогрупп (АМК-остатков ARG, LYS, HIS — с одной стороны и ASP, GLU — с другой) ≤ 4,5 Å;
• гидрофобные контакты: прямые взаимодействия между атомами углерода (C–C) ≤ 4,2 Å;
• Ван-дер-Ваальсовы контакты: слабые связи, не являющиеся водородными, атомов углерода с гетероатомами (C–O, C–N, C–S) ≤ 4,2 Å.

Результаты

Молекулярную реконструкцию комплекса рецепторного белка S и белка ионного канала Е бетакоронавируса человека (штамм Omicron, субтип ВА.5) проводили с помощью программы AlphaFold3. Для нерасщеплённого белка S0 брали полную последовательность АМК 14–1268 без первых 13 АМК сигнального пептида, который отщепляется котрансляционно сигнальной пептидазой при транслокации синтезируемого белка S0 в шероховатом клеточном ретикулуме c последующим конформационным созреванием молекул в аппарате Гольджи [5, 44].

В первой части проводили реконструкцию индивидуальных молекул каждого белка и ГК тримера S0 с белком Е, который был представлен ди-, три- либо пентамером. Полученные данные представлены на рис. 1. Исходно 3D-структуры тримера S0 и все исследованные мультимеры Е имели характерную трёхдоменную архитектуру, состоящую из наружного (так называемого эктодомена, ЭКД), трансмембранного (ТМД) и субмембранного (цитоплазматического, ЦПД) доменов. Полученные с помощью AlphaFold3 модели белков S и Е хорошо согласуются с характеристиками их общей архитектуры и доменной структуры, полученными в исследовании методами криоэлектронной микроскопии, рентгеноструктурного анализа и ядерно-магнитной резонансной спектроскопии [5, 12, 15, 18, 45, 46]. При образовании ГК существенно менялась достоверность структуры ТМД белка Е, которая из голубой области высокой достоверности (pLDDT 70–90) трансформировалась в структуру со сниженной достоверностью (pLDDT < 50), указывающей на сниженную упорядоченность данного домена в составе ГК. Главное наблюдение состояло в том, что ГК приобретали архитектуру «матрёшки», в которой мультимеры белка Е были погружены во внутренний объём тримера S0.

 

Рис. 1. Моделирование мультимолекулярных ГК, сформированных рецепторным белком S и ионным каналом Е коронавируса. Моделирование белковых молекул и их комплексов проводили с помощью сервера AlphaFold3. Показаны модели гомотримера белка S0 (а), гомотримера Е (б), ГК тримера S0 и тримера Е во фронтальной плоскости (в) и со стороны цитоплазматического домена канала Е (г) и апикальной части ГК (д). Цепочки молекул S0 и Е показаны серым и красным цветами соответственно; α- и β-спиральные участки — лентообразной линией и стрелками соответственно; неупорядоченные домены белков — непрерывной линией. Толстой стрелкой на панелях (б) и (в) показана локализация петли протеолитического сайта расщепления S0→S1/2. ТМД липидной мембраны отмечен серой штриховкой. На панелях (а), (б), (в) цветом указаны величины метрики pLDDT участков белковых молекул согласно цветовой шкале под рисунком: 1 — синий (> 90); 2 — голубой (90–70); 3 — жёлтый (70–50); 4 — оранжевый (< 50).

 

ЦПД тримерных белков S0 и Е претерпевали заметную конформационную трансформацию в С-концевых участках ГК, которые, как известно, локализуются под липидной мембраной и формируют разупорядоченные цепочки в ЦПД мультимеров S и Е (рис. 1, б). Структурные изменения этих доменов молекул S и Е в значительной мере могут быть обусловлены их участием во взаимодействии с матриксным белком М [5, 47, 48]. Однако этот аспект межбелковых взаимодействий вирусных белков S–M и Е–М не был предметом настоящего исследования.

Формирование ГК сопровождалось переходом упорядоченной α-спиральной конформации ЭКД свободного белка Е в разупорядоченную структуру в ГК S–E (рис. 1, a, б), что также нашло отражение в увеличении метрики RMSD у белка Е с 0,4–1,6 до 4,0–14,0 до и после образования комплекса с белком S соответственно (табл. 2).

 

Таблица 2. Структурные характеристики ГК S0-E

Структурные метрики	Комплекс 3S0–3E	Комплекс 3S0–2E	Комплекс 3S0–5E	Диапазон высокой достоверности значений
рТМ	0,76	0,77	0,74	0,6–1,0
iрТМ	0,74	0,76	0,71	0,6–1,0
Ranking score	0,79	0,81	0,79	0,7–1,5
pLDDT	74,89	74,98	72,82	60–100
RMSD позиций атомов в белках S / Е, Ǻ	1,6 / 12,1	0,4 / 4,2	1,0 / 14,0	< 2
Сlash score	0	0	0	0
Неупорядоченные участки молекул, %	16,59	17,57	20,34	< 50

Примечание. *Высокие значения неупорядоченных участков молекул, главным образом, относились к ЭКД и ЦПД в белке E.

 

В следующей серии экспериментов проводили реконструкцию ГК тримера S0 с ди- и пентамерами белка Е (рис. 2, а–г) в сравнении с моделью 3S0–3Е. Как видно на представленных моделях, ГК сохраняли архитектуру матрёшки и общее сходство с моделью ГК 3S0–3E, представленной на рис. 1, в которой молекулы тримера S0 взаимодействовали с мультимерным белком Е, главным образом гидрофобными ТМД (рис. 2, а, в). Важно, что во всех случаях — с ди-, три- и пентамерной формами белка Е — ГК сохранял внутренний трансмембранный канал, который не закрывался тримером S0 и проходил через весь ГК (рис. 1, д, е; рис. 2, б, г). Логично предположить, что такой сквозной проход мог обеспечивать трансмембранную канальную функцию белка Е.

 

Рис. 2. Структурные модели ГК, образованного тримером белка S0 с димером или пентамером белка Е. Показаны комплексы 3S0–2E (а, б) и 3S0–5E (в, г) белков вируса SARS-CoV-2, построенные с помощью программы AlphaFold3. Фронтальный вид ГК 3S0–2E (а), 3S0–5E (в), олигомеров 2Е (д) и 5Е (е). Показан вид снизу (б, г) ГК 3S0–2E и 3S0–5E соответственно. На панелях д, е цветом показаны величины метрики pLDDT участков белковых молекул согласно цветовой шкале под рисунком: 1 — синий (> 90); 2 — голубой (90–70); 3 — жёлтый (70–50); 4 — оранжевый (< 50). На панелях а–г серым цветом (5) показан белок S0, красным (6) — белок Е. Область липидной бислойной мембраны показана серой зоной, ограниченной пунктирной линией.

 

Программа AlphaFold3 позволяла определять количественные характеристики (метрики) построенных моделей ГК, которые перечислены в табл. 2. Реконструированные модели имели высокую степень достоверности, которая определялась параметром общей достоверности (ranking score) на уровне 0,79–0,81. Согласно протоколу программы, такая величина входит в диапазон больше 0,7 наивысшей достоверности структуры исследуемых объектов и позволяет считать структуру 3 комплексов (3S–2E, 3S–3E, 3S–5E) как устойчивую и высокодостоверную (табл. 1). Также обращали на себя внимание значительные различия средних отклонений расстояний между атомами в белковой цепи гомомультимера Е после формирования ГК S–E. Это величина параметра RMSD составила для белка Е 12,1 Ǻ, для белка S — 1,6 Ǻ. Такие различия величин RMSD для белков Е и S говорят, во-первых, о большей перестройке молекул Е при построении комплекса S–E и, во-вторых, указывают на высокую гибкость молекул Е, позволяющую существенно изменять свою конформацию в составе ГК по сравнению со структурой в гомомультимере, но при этом белок S лишь незначительно изменял позиции атомов при образовании ГК с белком Е.

Дополнительно обращали на себя внимание высокие значения таких важных метрик, как pTM и ipTM. Модели 3S0–2E и 3S0–3E имели высокие значения метрик в составе ГК (0,74–0,76). Метрики ГК 3S0–5E были ниже, чем моделей 3S0–2E и 3S0–3E (0,71–0,74; табл. 2). Допуская, что модели ГК 3S0–2E и 3S0–3E представляются наиболее достоверными и устойчивыми, логично предположить, что данные модели являются более предпочтительными и их можно оценивать как наиболее вероятные для существования in vivo в клетках и в составе вирионов.

Белок S0 (молекулярная масса 150–170 кДа) претерпевает двухэтапное протеолитическое расщепление по остаткам ARG в позициях 680 и 810 на два фрагмента S1 (~ 80 кДа) и S2 (~ 70 кДа), которое делает вирион инфекционным, т. е. способным инфицировать клетку-мишень [19, 49, 50]. Представляло интерес исследовать возможное влияние протеолиза белка S0 на структуру ГК S–E.

Для построения такой модели изменяли алгоритм ввода исходных белковых молекул, применяя последовательное введение аминокислотных последовательностей фрагментов S1→S2→E c тройным повторением. При моделировании комплексов с белком S1/2 использовали фрагменты, расщеплённые в первом фуриновом сайте по ARG-680. Это расщепление, как известно, происходит в клеточных зонах эндоплазматического ретикулума–аппарата Гольджи [20, 37, 39] и поэтому может участвовать во внутриклеточной сборке гетерокомплексов S1/S2–E на этапе их биосинтеза и мультимеризации. Во втором сайте S’2 (ARG-810) протеолиз протеазой TMPRSS2 или катепсином L мог происходить уже в сформированных ГК S1/S2–E либо при выходе вируса из клеток, либо при входе в клетку-мишень [50–53] и, вероятно, уже не мог влиять на процесс внутриклеточной сборки ГК S–E.

Модель структуры ГК S–E, построенная с расщеплённым белком S1/S2, показана на рис. 3. ГК 3(S1/S2)–3E имел общую архитектуру «матрёшки» и сохранял взаимное расположение индивидуальных доменов в комплексе 3S0–3E. В частности, у обоих белков S и E сохранялись ЭКД, ТМД и ЦПД и их взаимное расположение в комплексе, как это определялось выше в ГК 3S0–3E (рис. 1). Сходные модели типа «матрёшки» были получены для ГК 3(S1/S2)–3E, что дополнительно укрепляло положение о закономерной структурной реконструкции молекул в S1/S2–Е и S0–E по принципу «матрёшки» в ГК. Структурные метрики таких ГК сохранялись на высоком уровне (табл. 3), что указывало на сохранение высокой структурной достоверности и устойчивости структуры комплекса после протеазного расщепления белка S0→S1/S2.

 

Рис. 3. Молекулярная структура ГК, образованного белком ионного канала Е с расщеплённым рецепторным белком S1/S2 коронавируса SARS-CoV-2. Для построения моделей использовали первичные структуры белков S и Е у коронавируса SARS-CoV-2 (Omicron ВА.5; GenBank ac.n.PZ213865). Моделирование белковых молекул и их комплексов проводили с помощью сервера AlphaFold3. Показаны модели ГК тримера S1/S2 и тримера Е во фронтальной плоскости (а, б) с апикальной и цитоплазматической (в, г) сторон соответственно. Цепочки молекул S1/2 и Е выделены серым и красным цветами соответственно; α- и β-спиральные участки — лентообразной линией и стрелками соответственно; неупорядоченные домены белков — непрерывной линией. ТМД липидной мембраны отмечен серой штриховкой. На панели а цветом указаны величины метрики PDLL участков белковых молекул согласно цветовой шкале под рисунком: 1 — синий (> 90); 2 — голубой (90–70); 3 — жёлтый (70–50); 4 — оранжевый (< 50).

 

Таблица 3. Структурные характеристики ГК расщеплённого белка S1/S2 с белком Е

Структурные метрики	Комплекс 3(S1/S2)–3E*	Диапазон оптимальных значений
рТМ	0,76	0,6–1,0
iрТМ	0,76	0,6–1,0
Ranking score	0,82	0,7–1,5
pLDDT	76,01	60–100
RMSD для гетерокомплекса 3(S1/S2)–3E в белках S / Е, Ǻ	2,1 / 10,4	< 2
Clash score	0	0
Неупорядоченные участки молекул, %	13	< 50

Примечание. *Реконструирование структуры ГК выполнено с рецепторным белком S1/S2, расщеплённым в протеазном сайте Arg680.

 

Можно сделать следующие выводы:

1) достоверность построенной модели ГК была близка таковой для ГК с нерасщеплённым белком 3S0–3Е, представленного в табл. 2;

2) полученные метрики с высоким ranking score 0,79–0,81 и высокими ipTM и рТМ (0,74 и 0,76 соответственно) позволяют считать предсказанную модель ГК достоверной и структурно высоко устойчивой;

3) в ГК 3(S1/S2)–3Е сохранялся свободным трансмембранный проход, что указывало на сохранение возможности сквозного транспорта ионов через данный ГК после расщепления S0 на фрагменты S1 и S2 (рис. 3, в, г).

При исследовании ГК были обнаружены важные сдвиги, затрагивающие структуру области протеолитической петли в зоне сайта протеолиза S’2. Отмечено изменение вторичной структуры данного сайта S’2 (АМК-последовательность …SKPSKR₈₁₀↓SFIE…; рис. 4, а). До взаимодействия с белком Е исходный олигомер 3S0 в участке АМК 833–850, прилежащем к сайту S’2, имел α-спиральную структуру и локализовался на дистанции 26 Ǻ от ключевого ARG810 (рис. 4, а). После образования ГК с белком Е этот участок в S0 переходил в разупорядоченную структуру, и, напротив, смежный участок АМК 827–838 приобретал конформацию α-спирали (рис. 4, б). Возникший α-спиральный участок (АМК: 827–838) существенно приближался к сайту протеолиза S’2 на расстояние 12 Ǻ, ограничивая доступ протеаз к сайту S’2 (АМК: 810–820) (рис. 4, б).

 

Рис. 4. Изменение вторичной структуры сайта протеолиза S’2 при формировании ГК 3S0–3E. Показан участок 3D-структуры молекулы S0 (АМК: 794-FNFSQILPDPSKPSKR↓SFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTV-855) в составе олиготримера 3S0 до (а — выделено красным) и после (б — выделено зелёным) образования ГК 3S0–3E. в — совмещение положения белковых цепей S0, показанных на панелях а и б. Короткой стрелкой указан сайт S’2 протеолитического расщепления протеазами TMPRSS2 (R810) и катепсин К, L, В (S808, S811, F812). α-Спиральные и разупорядоченные участки в белковых молекулах S0 показаны лентообразной и непрерывной линиями соответственно. Цифры — позиции АМК от инициаторного метионина в белке S0, Omicron ВА.5 (GenBank ac.n. PZ213865). Звездочка — остаток D838, которым заканчивается α-спираль G827–D838, сближающаяся с протеолитическим сайтом R810 с 26 Å до 12 Ǻ (дугообразная стрелка).

 

Представляется вполне логичным, что такая перестройка могла снижать чувствительность протеолитической петли S’2 к протеолизу, поскольку α-спирали менее восприимчивы к связи с протеазами, чем последовательности с разупорядоченной структурой АМК [54–56]. Обнаруженная перестройка в зоне S’2 ГК S0–Е может влиять на его расщепление трипсиноподобной протеазой или катепсином, которое, как известно, заметно влияет на патогенность и контагиозность коронавирусов [19, 23, 24].

Далее исследовали контакты АМК между белковыми цепями белка Е в ГК 3S0–3E. Такой анализ проводили с учётом правила, согласно которому соседние АМК могут существенно взаимодействовать друг с другом на расстоянии, не превышающем 7 Ǻ [56]. Идентификация таких контактов и оценка их химической природы отражены в табл. 4. Видно, что доминирующая часть АМК-связей имела гидрофобный характер и была сосредоточена в ТМД. Устранение прямого контакта белка Е с липидной мембраной за счёт его экранирования белком S и наличие лишь единичных электростатических АМК-связей между белковыми цепями S и Е в трансмембранном участке ГК S–E может увеличивать подвижность цепей ионного канала Е и иметь регуляторный характер, облегчающий транспорт ионов через вирусный ионный канал. Для внутренней полости ионного канала Е необходима повышенная подвижность его α-спиралей и преобладание гидрофобных связей внутри вирусного ионного канала Е, с которыми связано продвижение ионов в трансмембранной части канала [12, 57–60].

 

Таблица 4. Характеристика природы связей АМК в интерфейсах белка Е в гетерокомплексе 3S0–3E

Домен (позиции АМК)1)	Число H-связей*, n (%)	Число электростатических связей, n (%) (или ионных связей)	Число гидрофобных связей*, n (%)	Число связей Ван-дер-Ваальса*, n (%)	Суммарное число связей в домене
ЭКД (1–9)	2 (4,7)	0 (0)	36 (83,7)	5 (11,6)	43
ТМД (10–30)	2 (0,5)	0 (0)	344 (86,4)	52 (13,1)	398
СМД (31–75)	5 (1,5)	2 (0,6)	310 (90,6)	25 (7,3)	342

Примечание. *Оценку природы и дистанции связей между белками Е и S в ГК 3S0–3E проводили в среде PyMOL при следующих критериях: водородные связи до 3,8 Å; электростатические (ионные) взаимодействия между противоположно заряженными атомами гетерогрупп на расстоянии до 4,5 Å; гидрофобные взаимодействия между атомами углерода (C–C) на расстоянии до 4,2 Å; связи Ван-дер-Ваальса между неполярными и полярными атомами (в пределах 4,2 Å).

 

Отдельного рассмотрения заслуживают альтернативные модели, построенные программой AlphaFold3, в которых белок Е взаимодействовал с ТМД тримера S, располагаясь от него снаружи (рис. 5). При этом расстояние между цепями белка Е в гомопентамере 5E и в ГК 3S–5E возрастало с ~ 10 Å до ~ 28 Ǻ соответственно. Такой ГК имел высокие структурные метрики, указывающие на достоверность моделей и их структурную устойчивость. Так, ranking score моделей составлял 0,78, метрики pTM, ipTM, clash (недопустимые столкновения) — 0,73, 0,71 и 0,0 соответственно, а неупорядоченные участки — 13%. Очевидно, что такая архитектура ГК будет приводить к нарушению функции ионного канала Е. Однако представленные оригинальные модели структур S–E ГК с внешним расположением белка Е могут создавать новые и пока неизвестные функции у белков E и S (отсутствие активности ионного канала, изменения внутриклеточного транспорта комплекса S–E и др.) как для поддержания вирусной репликации, так и для воздействия на клеточный метаболизм. Такое предположение о новых функциональных активностях у белков S и E согласуется с экспериментальными данными о множественности внутриклеточных функций данных белков, но пока с мало понятными механизмами, такими как уклонение вируса от иммунной реакции, их участие в регуляции программируемой смерти инфицированных и иммунных клеток организма-хозяина и др. [2, 61, 62].

 

Рис. 5. Альтернативная структура ГК, образованного рецепторным белком S и ионным каналом Е коронавируса. Молекулярная модель ГК 3S0–5E белков вируса SARS-CoV-2 построена с помощью программы AlphaFold3. Приведены модели ГК во фронтальной плоскости (а), в вертикальной плоскости с цитоплазматической стороны (б). Цепочки молекул S0 и Е показаны серым и красным цветами соответственно; α- и β-спиральные участки — лентообразной линией и стрелками соответственно; неупорядоченные домены белков — непрерывной линией. ТМД липидной мембраны отмечен серой штриховкой.

 

Обсуждение

В настоящей работе на модели бетакоронавируса человека впервые описан ГК двух белков: ионного канала Е и рецепторного белка S, имеющий архитектуру «матрёшки», в которой мультимер Е полностью погружен в тример S. Аналогичные структуры «матрёшки» были получены для ди-, три- и пентамеров белка Е с тримером S. Однако, какой из указанных ГК доминирует в зрелом вирусе или в инфицированной клетке, остаётся не ясным.

Не исключено, что каждый ГК может иметь специализированную функцию в клетке или вирионе. Хорошо известно, например, о наличии ряда иммунологических функций у белка Е, связанных с наличием С-концевого PDZ-связывающего мотива, и о роли белка Е в регуляции апоптоза инфицированных клеток [59, 61–64]. В этой связи уместно отметить об обнаружении специфического ГК S–Е, в котором белок Е локализован снаружи тримера S, но и такой белковый комплекс, как показано на рис. 5, имел высокие структурные метрики и мог иметь влияние на функцию белка S и самого белка Е и порождать новые свойства у белков S и Е как в сборке вирионов, так и в изменении клеточного метаболизма и функции клеточных ионных каналов в случае их взаимодействия с белком Е. Таким образом, представляется логичным, что в жизненном цикле вируса белок Е может иметь более одной структурной формы и выполнять внутриклеточные поливалентные функции.

Реализации множественных функций белка Е может способствовать и то обстоятельство, что для сборки вирионов используется не более 10% пула синтезированных внутри клеток вирусных белков [4, 65]. Однако для дальнейшего понимания возможной биологической роли образования ГК вирусных белков S–E и возникновения новых функций у данного комплекса потребуются дальнейшие экспериментальные подтверждения их взаимодействия в инфицированных клетках и в вирионах методами иммунной копреципитации со специфическим антителами либо рекомбинантным методом бимолекулярной флуоресцентной комплементации белков (BiFC).

Наибольшее количество связей гидрофобного характера между АМК белков Е и S в изученных ГК обнаруживалось в ТМД и ЦПД канала Е при отсутствии ионного взаимодействия между цепями белков Е и S (табл. 4). Отсутствие в ТМД сильных межбелковых связей способствовало большей подвижности трансмембранной части ионного канала. Известно, что высокая подвижность белковых цепей вирусного канала важна для прохождения ионов [2, 58, 59, 66]. Окружение канала Е молекулами белка S также могло ослаблять взаимодействие с липидами клеточных мембран в ТМД и влиять на ионную селективность канала коронавирусов преимущественно для катионов Na⁺, К⁺, Н⁺, Са²⁺ [2, 65, 67]. Известно, что на селективность катионной проводимости каналов Е, помимо прямого влияния АМК белковой части канала, может оказывать влияние липидное окружение мембран [58, 60]. По этой причине активность каналов коронавируса в инфицированных клетках может варьировать в зависимости от локализации в специфических клеточных компартментах, различающихся, как известно, липидным составом.

Архитектура ГК S–E в форме «матрёшки» инициирует логичный вопрос: каким образом и в каком клеточном компартменте мог образоваться такой мультимолекулярный комплекс? Оба белка синтезируются в заражённых клетках на рибосомах, связанных с мембранами шероховатого околоядерного эндоплазматического ретикулума, и далее собираются в тримеры S0 и мультимеры Е уже в везикулярной промежуточной зоне (промежуточный компартмент между эндоплазматическим ретикулумом и аппаратом Гольджи?), в которой происходит сборка вирионов в структурах, получивших название двухмембранные везикулы (ДМВ) [5, 44]. Вполне логично, что в ретикулярной зоне эндоплазматического ретикулума–Гольджи часть молекул может объединяться и формировать ГК S0–E, которые затем, соединяясь с матриксным вирусным белком М, будут формировать центры почкования вирионов в составе внутриклеточных липидсодержащих ДМВ [5, 48, 68, 69].

Остаётся открытым вопрос о количественном составе мультимолекулярного гомомультимера белка Е. Имеются данные о ди-, три- и пентамерных комплексах белка Е [10, 11]. Однако в опытах in vivo в инфицированных клетках выявлялись преимущественно димеры и тримеры белка Е [7–9, 11]. Предсказанные модельные структуры показывают, что повышенными структурными метриками обладают ГК 3S–2E и 3S–3E, что позволяет рассматривать их как наиболее физиологичные и конгруэнтные белковые мультимеры. Пока нет сравнительных данных о канальной активности ди-, три- и пентамеров белка Е коронавирусов, тогда как для похожего канала М2 вируса гриппа есть наблюдения о более высокой канальной активности для димеров и тримеров по сравнению с тетрамерами ионного канала М2 [70, 71]. Исследование данного вопроса требует дальнейшего прямого выявления вирусных ГК в клетках методами бимолекулярной флуоресцентной комплементации белков (BiFC) и избирательной копреципитации комплексов из инфицированных клеток и вирионов антителами к белкам S и E.

Важно обратить внимание на очевидное сходство двух представителей оболочечных РНК-геномных вирусов: вирусов гриппа и коронавирусов. В частности, на наличие у рецепторных белков S0 (коронавируса) и НА0 (вируса гриппа) сходного протеолитического расщепления S0→S1/2 и НА0→НА1/2, необходимого для слияния вирусной и клеточной липидных мембран, которое происходит при участии вирусных ионных каналов Е (у коронавирусов) или М2 (у вирусов гриппа А), обеспечивающих закисление вириона и рН-зависимый выход вирусного РНП в цитоплазму клеток-мишеней [20, 21, 45, 72, 73]. Как было показано для вируса гриппа А, нерасщеплённый гемагглютинин НА0 стабилизирует вирион и закрывает ионный канал М2, но открывает его после разрезания НА0 на НА1 и НА2, обеспечивая инфекционность [74–76]. Вполне возможно, что для коронавирусов может существовать аналогичный механизм стабилизации вирусных частиц нерасщеплённым рецепторным белком S0, функционирующим в кооперации с белком Е, но пока это предположение остаётся неисследованным. В этом случае для осуществления такой связи представляется вполне логичной описанная модель «матрёшки» ГК S–E, аналогичная таковой у белков НА-М2 в вирусе гриппа А [77]. Помимо структурной стабилизации, структура «матрёшки» будет облегчать функциональную кооперацию белков S и Е при входе вируса в клетку-мишень, когда оба белка синхронно претерпевают рецептор-связанные и рН-зависимые конформационные переходы, необходимые для слияния вирусной и клеточной мембран, последующего выхода вирусного РНП в клеточную цитоплазму и начала репликации вирусного генома [20, 21, 46, 72].

Заключение

Полученные данные о существовании у коронавирусов ГК между рецепторным белком S и белком ионных каналов Е демонстрируют новые структурные формы и многообразие межбелковых взаимодействий в составе вируса и в заражённых клетках. В частности, описан новый структурный тип интеграции двух различных белков в ГК, имеющий молекулярную архитектуру «матрёшки», когда один белок полностью погружён в другой, служащий внешним экраном и, возможно, регулятором его функции. Проведённое моделирование уникальной структуры межбелковых ГК между вирусными белками S и E даёт основание для предсказания новых механизмов для регуляции функций вирусных белков и позволяет сделать предположение о существовании неизвестных ранее регуляторных процессов в репликации самого вируса и регуляторных воздействий на клеточные процессы как в заражённых клетках, так и в целостном организме, а также в поддержании стабильности вируса в заражённом организме и во внешней среде.

 

¹ URL: https://alphafold.ebi.ac.uk/

About the authors

Alyona I. Chernyshova

D.I. Ivanovsky Institute of Virology, N.F. Gamaleya Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology

Email: immunol.lab@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-1290-4042

junior researcher, Laboratory of immunology, D.I. Ivanovsky Institute of Virology

Russian Federation, Moscow

Oleg P. Zhirnov

D.I. Ivanovsky Institute of Virology, N.F. Gamaleya Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology; Russian-German Academy of Medicosocial and Biotechnological Sciences

Author for correspondence.
Email: zhirnov@inbox.ru
ORCID iD: 0000-0002-3192-8405

Dr. Sci. (Biol.), Professor, Corr. Member of the RAS, Head, Laboratory of viral pathogenesis, Head, Laboratory of viral pathogenesis

Russian Federation, Moscow; Moscow

References

Supplementary files