Application of flow cytometry for rapid and precise quantification of Candida albicans cells in samples

Full Text

Введение

Микозы занимают существенную долю (около 15–20%) в структуре инфекционных причин смерти населения [1]. Согласно недавнему анализу эпидемиологических данных за период с 2010 по 2023 г., ежегодно регистрируется около 6,5 млн случаев инвазивных микозов, приводящих к 3,8 млн смертей [2].

ВОЗ и Международное общество по инфекционным заболеваниям проявляют опасения в связи с увеличением и без того высокой частоты микозов¹ и расширения их географического распространения в мире [3]. Рост показателей заболеваемости и смертности обусловлен двумя ключевыми группами факторов: появлением и распространением штаммов, резистентных к противогрибковым препаратам [4], а также увеличением числа лиц из групп риска — в том числе пациентов с иммуносупрессией (ВИЧ-инфицированных, больных со злокачественными новообразованиями) [5, 6], а также катетеризованных пациентов или находящихся на искусственной вентиляции лёгких [7, 8]. В 2022 г. ВОЗ провела комплексную оценку степени угрозы для здравоохранения патогенных для человека грибов по 10 критериям, включая показатели распространения, заболеваемости и летальности, по результатам которой виды Cryptococcus neoformans, Candida auris, Aspergillus fumigatus, C. albicans признаны приоритетными для активизации эпидемиологического надзора, медицинской помощи, а также исследований, направленных на изучение механизмов химиорезистентности грибов, патогенеза вызываемых ими заболеваний и разработки более эффективных подходов для терапии микозов [9].

Проведение фундаментальных и прикладных исследований невозможно без использования клинически релевантных инфекционных моделей in vivo на лабораторных животных. Для получения воспроизводимых результатов принципиально важно применять точные методы подсчёта клеток патогена как на этапе подготовки культуры для заражения животных, так и при определении диссеминации патогена в организме и эффективности проводимой терапии [10, 11].

Наиболее широко распространённым методом количественного определения жизнеспособных микроорганизмов является посев анализируемых образцов на плотные питательные среды (ППС) с последующим подсчётом колониеобразующих единиц (КОЕ) [12]. Данный метод при должной квалификации прост в проведении, не требует высокотехнологичного оборудования, позволяет получать точные воспроизводимые результаты, а также может применяться для детекции определённого возбудителя в смеси микроорганизмов с использованием селективных питательных сред. С другой стороны, известны и недостатки этого метода. Одним из важных является отсроченность получения результата, связанная со временем деления микроорганизмов и появления колоний (от 18 ч). В случае подготовки культуры для заражения животных возможность определения концентрации патогена в тот же день для подбора заданной экспериментатором дозы имеет принципиальное значение. К другим недостаткам метода определения КОЕ можно отнести невозможность учёта некультивируемых, но живых форм микроорганизмов; отсутствие информации о соотношении живых и мертвых клеток в исследуемом образце [13].

В качестве альтернативного подхода применяют денситометрические методы (например, определение оптической плотности суспензии по стандартам мутности по МакФарланду), которые, несомненно, быстрее в проведении, однако сильно искажают результаты при наличии включений/агрегатов, обладают большей погрешностью по сравнению с методом подсчёта КОЕ и также не способны определять долю жизнеспособных клеток в образце. Подсчёт клеток в счётной камере (с возможностью добавления витальных красителей) имеет высокую погрешность из-за малого объёма образца, используемого для анализа, что определяет необходимость многократного повторения измерений проб с патогеном [14].

В связи с этим актуальными задачами исследовательских лабораторий являются разработка и внедрение методов, сочетающих высокую скорость анализа с точностью количественной оценки жизнеспособных микроорганизмов в анализируемых образцах. Метод проточной цитометрии (ПЦМ) с использованием дополнительных реагентов может помочь в решении данной задачи [15]. Современные цитометры способны анализировать сотни тысяч клеток в пробе в течение нескольких минут, обеспечивая высокую статистическую достоверность. Наличие приборов с объёмной (с перистальтическим насосом) системой подачи образца позволяет определять концентрацию клеток без использования калибровочных частиц. Обладая небольшими размерами, некоторые модели цитометров могут быть помещены в боксы биологической безопасности, что позволяет работать с патогенными биологическими агентами различных групп патогенности. Использование флуоресцентных витальных красителей и видоспецифичных антител позволяет не только селективно определять количество исследуемого микроорганизма вне зависимости от наличия включений, но и оценивать его жизнеспособность. Ранее была показана возможность применения метода ПЦМ для подсчёта C. albicans в культуре [16–18]. Однако применимость метода ПЦМ для стандартизации образцов C. albicans для получения летальной модели диссеминированного кандидоза мышей остаётся неопределённой. Кроме того, в литературе отсутствуют данные, показывающие перспективы применения данного метода для точного определения количества живых клеток C. albicans в биообразцах, содержащих погибшие клетки C. albicans, а также клетки млекопитающих.

Цель исследования состояла в разработке метода быстрого количественного определения микроорганизмов на примере грибов C. albicans в чистой культуре, а также в многокомпонентных смесях (с добавлением инактивированной C. albicans и крови мышей) на основе ПЦМ.

Материалы и методы

Растворы и бактериальные среды

Использовали среду Сабуро («Himedia»), содержащую 50 мг/л хлорамфеникола, фосфатно-солевой буфер (PBS; pH 7,2)

Изолят

Изолят C. albicans GIMC100:CaMK2014SRP выделяли из почек мыши C57BL/6 после единственного in vivo пассажа клинического штамма C. albicans CaMK2014 из Государственной коллекции патогенных микроорганизмов II–IV групп патогенности НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи. Геном изолята GIMC100:CaMK2014SRP секвенировали и депонировали в GenBank NCBI (BioProject ID PRJNA1465212; SAMN59737234).

Лабораторные животные

Самок мышей BALB/c (4–5 нед, SPF статус) приобретали в НПП «Питомник лабораторных животных» ФИБХ РАН (Пущино). Мышей содержали в индивидуально вентилируемых системах ISOCage P («Techniplast») со свободным доступом к автоклавированной питьевой воде со стандартным рационом питания.

Эксперименты были выполнены с соблюдением морально-этических принципов при работе с лабораторными животными в соответствии с положениями Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях. Проведение научного исследования было одобрено Комитетом по биомедицинской этике НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи (протокол № 79 от 22.10.2024).

Культивирование C. albicans

Культуру C. albicans наращивали в 200 мл жидкой среды Сабуро («Himedia»), содержащей 50 мг/л хлорамфеникола, 16 ч при 37°C. По завершении инкубации клетки двукратно центрифугировали (2000g, 10 мин) и отмывали в PBS. Часть исходной суспензии культуры отбирали для приготовления мертвых клеток C. albicans. Для этого 500 мкл суспензии вносили в микропробирки и инкубировали в твердотельном термостате «Гном» («ДНК-Технология») 1 ч при 70°С.

Определение количества клеток C. albicans в счётной камере

Концентрацию клеток C. albicans в полученной суспензии определяли с помощью камеры Горяева («Мини-Мед»). Для этого 10 мкл исследуемого образца смешивали с 10 мкл 0,4% раствора трипанового синего («Bio-Rad»); полученной смесью заполняли камеру Горяева и проводили под микроскопом («Olympus») подсчёт клеток. Измерения повторяли 10 раз и рассчитывали среднее арифметическое значение концентрации.

Приготовление многокомпонентных образцов

Эвтаназию мышей проводили посредством ингаляции CO₂, следуя принципам, изложенным в Рекомендациях Европейской комиссии по эвтаназии экспериментальных животных². Кровь мышей получали при пункции сердечной мышцы. Образцы собирали в гепаринизированные пробирки (500 ЕД/мл, «Эллара»). Эритроциты разрушали лизирующим буфером («BD Biosciences») и отмывали в PBS центрифугированием (2000g, 10 мин). Для приготовления многокомпонентных образцов смешивали суспензии живых клеток C. albicans, инактивированных нагреванием C. albicans и форменных элементов крови мышей, оставшихся после лизиса эритроцитов, в соотношении 1:1:1.

Определение количества клеток C. albicans по КОЕ

Для определения количества КОЕ в суспензии производили высев исследуемых образцов в повторах на чашки с ППС Сабуро-агар с декстрозой («Himedia»). Чашки инкубировали 24 ч при 37°С, после чего проводили визуальный подсчёт колоний.

Анализ содержания C. albicans на цитометре

Измерения проводили на проточном цитометре «BD Accuri C6 Plus» c программным обеспечением «BD CSampler» («Becton Dickinson»). Для селективного окрашивания C. albicans в образцы (100 мкл) добавляли моноклональные видоспецифичные FITC-меченные антитела (ab21164, «Abcam») в концентрации 1 мкг/мл, инкубировали в темноте 15 мин при 4°C. После окрашивания в пробирки добавляли 1 мл PBS, центрифугировали при 2000g 10 мин при 4°С. Надосадок удаляли, осадок ресуспендировали в 100 мкл PBS. Для оценки жизнеспособности культуры непосредственно перед анализом в образцы добавляли йодид пропидия («Thermofisher») в концентрации 1 мкг/мл.

Заражение животных C. albicans

Мышам вводили суспензию C. albicans, разведённую в 100 мкл PBS (рН 7,7) в дозах: 0,5 × 10⁶, 1,0 × 10⁶ и 2,0 × 10⁶ КОЕ/животное. Животных предварительно нагревали с помощью тепловой пушки в течение 2 мин, после чего фиксировали и вводили суспензию C. albicans в латеральную хвостовую вену с помощью шприца с диаметром иглы 29G.

Статистическая обработка данных

Для статистической обработки данных использовали программы «GraphPad Prism 6» («GraphPad Software Inc.») и «Microsoft Excel» («Microsoft Corporation»).

Результаты

Количественное определение C. albicans в чистой культуре

Параметры (динамический диапазон, предел чувствительности, коэффициенты вариации) метода ПЦМ, предлагаемого для количественной оценки C. albicans в образцах, сравнивали с методом посева на твёрдую среду Сабуро с последующим подсчётом КОЕ. На первом этапе определяли применимость метода ПЦМ для стандартизации образцов C. albicans, используемых для разработки модели летальной кандидозной инфекции лабораторных животных. Объектом исследования выступала суспензия живых клеток C. albicans, полученная после 16 ч инкубации при 37°С в жидкой среде Сабуро (рис. 1).

 

Рис. 1. Сравнение методов ПЦМ и подсчёта КОЕ для количественного определения C. albicans в выращенной культуре. а — схема проведения эксперимента, отражающая основные манипуляции и применяемые методы, включая репрезентативные визуализированные результаты анализа образца методом ПЦМ. б — результаты количественного определения C. albicans в серийных разведениях; CV, % — коэффициент вариации. в — графическое отображение полученных результатов. Черная пунктирная линия — линия тренда (корреляции) значений, полученных в счётной камере Горяева и методом подсчёта КОЕ. Красная линия — кривая зависимости значений, полученных в счётной камере Горяева и методом подсчёта КОЕ. Синяя линия — кривая зависимости значений, полученных в счётной камере Горяева и методом ПЦМ. r — коэффициент корреляции Спирмена. г — выживаемость мышей линии BALB/c после внутривенного заражения C. albicans в разных дозах (n = 6). Сравнение кривых выживаемости животных проводили с использованием лог-рангового критерия между дозами 10⁶ КОЕ или 2,5 × 10⁶ КОЕ против 0,5 × 10⁶ КОЕ (*p < 0,0005) и дозой 10⁶ КОЕ против 2,5 × 10⁶ КОЕ (^#p < 0,0005).

 

Исходную концентрацию C. albicans в полученной культуре определяли методом подсчёта в камере Горяева (10 измерений; рис. 1, а). Полученные данные (среднее арифметическое) использовали для приготовления 10-кратных серийных разведений (8 повторений объёмом 1 мл) культуры с концентрациями в диапазоне от 1 до 1 млн клеток на 100 мкл. Таким образом, значения, полученные методом подсчёта клеток в камере Горяева, использовали в качестве референсных. Далее каждую аликвоту использовали для количественного определения C. albicans методами подсчёта КОЕ и ПЦМ. В связи с ограничением в подсчёте КОЕ на чашке при посеве C. albicans на ППС максимальная концентрация клеток составила 1000 клеток на образец. Значения в каждой пробе, определённые каждым из использованных методов, представлены на рис. 1, б. Полученное среднее арифметическое для каждой пробы, определённое методом посева C. albicans на ППС (красные точки) или ПЦМ (синие точки), было использовано для построения графиков зависимостей относительно среднего арифметического, определённого в счётной камере Горяева (рис. 1, в). Метод подсчёта КОЕ C. albicans показывал близкие к расчётным (определённые в камере Горяева) значения в диапазоне 1–1000 клеток на образец (r = 0,9917). ПЦМ обладает более широким динамическим диапазоном и позволяет определять концентрации C. albicans до 1 млн клеток в пробе. В связи с этим коэффициент корреляции оказался выше (r = 0,9999), однако в диапазоне низких концентраций C. albicans (1 и 10 клеток на образец) средние значения, полученные методом ПЦМ, сильно отклонялись от расчётных (в 8,4 и 1,8 раза соответственно). Стоит отметить также, что каждый из использованных методов показывает высокие коэффициенты вариации между пробами в диапазоне низких концентраций C. albicans (1–10 клеток на образец). Полученные результаты определяют ограничение ПЦМ для подсчёта C. albicans в образцах, содержащих единичные клетки. Для получения более достоверных значений при низкой концентрации C. albicans в образцах метод подсчета КОЕ требует использования нескольких повторностей.

Таким образом, ПЦМ позволяет получить воспроизводимые данные в диапазоне концентраций C. albicans от 100 до 1 млн клеток на образец. Интересно, что в указанном интервале с увеличением концентрации C. albicans в образце коэффициент вариации значений снижается (с 7,6 до 0,8%).

Определение концентрации патогена для установления дозы заражения животных имеет принципиальное значение, в связи с чем метод посева на ППС не может быть применён для стандартизации образцов в экспериментах на животных.

Для демонстрации влияния заражающей дозы C. albicans на выживаемость животных мы использовали тот же изолят патогена. Для моделирования диссеминированного кандидоза мышам линии BALB/c вводили в хвостовую вену 0,5 × 10⁶, 10⁶ и 2,5 × 10⁶ КОЕ C. albicans на животное. Учёт гибели животных проводили в течение 17 дней. По результатам эксперимента было определено, что двукратное изменение дозы принципиально влияет на выживаемость животных (рис. 1, г). Так, использование дозы 0,5 × 10⁶ КОЕ на животное не приводило к смерти животных. Тогда как 10⁶ и 2,5 × 10⁶ КОЕ приводило к 100% летальности. Важно отметить, что кривые выживаемости значительно отличались в группах 10⁶ и 2,5 × 10⁶ КОЕ на животное, что подтверждается высокой статистической достоверностью (p < 0,0005 по лог-ранговому критерию). Полученные данные определяют важность точного подсчёта C. albicans для заражения животных. Принимая во внимание невозможность применения подсчёта КОЕ, для стандартизации образцов C. albicans перед заражением животных предпочтительным выбором становится ПЦМ по сравнению с определением единиц мутности по МакФарланду.

Количественное определение C. albicans в образцах с примесями

ПЦМ позволяет использовать дополнительные реагенты (антитела, флуоресцентные красители) для селективной детекции микроорганизмов в многокомпонентных смесях. Такой подход существенно расширяет возможности метода, позволяя использовать различные биологические образцы (кровь, моча и др.) с целью определения содержания живых клеток патогена. Другой областью применения может быть быстрая оценка эффективности противогрибковых (антимикотических) препаратов без необходимости дополнительных временны́х затрат для определения количества выживших микроорганизмов по КОЕ. Для определения применимости предлагаемого метода с использованием ПЦМ были получены образцы, воспроизводящие вышеуказанные условия. Из исходной культуры C. albicans было приготовлено три 10-кратных разведения (образцы объёмом 1 мл) по 5 повторений для каждого. Для имитации биологического образца, поступившего на анализ, в пробы были добавлены образцы крови (после лизиса эритроцитов) мыши, а таже C. albicans, инактивированная нагреванием (рис. 2).

 

Рис. 2. Сравнение результатов количественного определения C. albicans в многокомпонентных образцах методами ПЦМ и подсчёта КОЕ. а — схема проведения эксперимента, отражающая основные манипуляции и применяемые методы. б — репрезентативные результаты визуализации результатов ПЦМ для количественного определения живых клеток C. albicans с использованием пропидий иодида (PI) и флуоресцентно меченных (FITC) специфичных антител. Зелёным цветом отмечены детектируемые живые клетки C. albicans, используемые при расчёте. в — результаты количественного анализа живых клеток C. albicans в 3 образцах (по 5 повторностей), полученные методом ПЦМ и подсчётом КОЕ. Столбики отражают среднее арифметическое. Точки соответствуют аликвотам. Нд — нет достоверных различий между группами данных по критерию Манна–Уитни.

 

Каждую пробу использовали для количественного определения C. albicans методами подсчёта КОЕ и ПЦМ. При подсчёте КОЕ для точного определения их количества проводили дополнительное разведение проб перед посевом на ППС. Для специфической детекции живых клеток методом ПЦМ в пробы добавляли краситель пропидий иодид (PI), проникающий внутрь клеток с повреждённой мембраной, а также антитела, конъюгированные с флуоресцентной меткой (FITC), специфичные к патогену. Применяя данный подход, с помощью метода ПЦМ обнаружили кластер живых (FITC⁺, PI^–) и мёртвых клеток C. albicans (FITC⁺ и PI⁺), а также присутствие в образцах клеток крови мыши и дебриса (FITC^– и PI^–; рис. 2, б). Сравнение количества жизнеспособных клеток C. albicans, определённого методом подсчёта КОЕ и ПЦМ, показало равные значения (различия в выборках данных статистически не достоверны) в каждом из проанализированных образцов (рис. 2, в). Полученные результаты свидетельствуют о применимости ПЦМ для количественного определения C. albicans в многокомпонентных образцах, которые могут использоваться в экспериментальной и клинико-диагностической работе.

Обсуждение

В работе микробиологических лабораторий метод посева микроорганизмов на ППС с последующим подсчётом КОЕ является базисным для решения задач по количественному определению микробной нагрузки в образцах. Разработанный ещё в XIX в. метод сохраняет свою актуальность, благодаря ряду особенностей: простоте выполнения, высокой точности, возможности использования селективных и дифференциальных сред для определённых микроорганизмов [19]. Однако он требует значительного времени (не менее 18 ч) для роста колоний и их визуального подсчёта. Этот недостаток определяет существенные ограничения в его применении в случае использования культур микроорганизмов для получения летальных инфекционных моделей на лабораторных животных. С целью быстрого определения концентрации микроорганизмов используют денситометрические методы, которые не отличаются высокой точностью анализа. Известно, что данный метод обладает высокой погрешностью (различные препараты одного и того же штамма могут отличаться по КОЕ в несколько раз) относительно метода посева на ППС [20, 21]. В связи с этим доза патогена, использованная для заражения животных, может отличаться в разы между экспериментами.

Ранее возможность использования ПЦМ для анализа C. albicans демонстрировалась в контексте оценки чувствительности к антимикотикам и подсчёта жизнеспособных бластоспор. Так, было показано, что ПЦМ позволяет проводить быстрые тесты чувствительности C. albicans к противогрибковым препаратам, что подтверждает принципиальную применимость метода для функциональной оценки жизнеспособности грибов [16]. Для подсчёта жизнеспособных бластоспор C. albicans оценивали применимость красителей эозина Y [17] TO-PRO-3 [18] и калькофлуора [22], тем самым показывая, что ПЦМ способна обеспечивать точный учёт грибковых клеток в суспензии. Используя в работе культуру живых клеток C. albicans, мы показали, что ПЦМ пригодна для экспресс-определения (в течение 1 ч) количества клеток C. albicans, демонстрируя сравнимую относительно метода подсчёта КОЕ точность, но при этом обладая более широким динамическим диапазоном (от 100 до 1 млн клеток на 100 мкл). В контексте применения метода для стандартизации образцов, используемых для заражения лабораторных животных, полученные результаты представляются крайне значимыми. Нами установлено, что двукратное изменение заражающей дозы C. albicans (1 × 10⁶ и 2,5 × 10⁶ КОЕ на животное) приводит к значимым различиям в выживаемости мышей (p < 0,0005). Эти результаты показывают, что даже относительно небольшие отклонения фактической дозы от расчётной способны принципиально изменить исход эксперимента, подчёркивая критическую важность точного количественного определения клеток патогена на этапе выбора доз C. albicans для заражения животных.

Ещё одной важной задачей настоящего исследования является демонстрация возможности количественного определения живых клеток C. albicans в многокомпонентных образцах, включающих эукариотические клетки и мёртвые клетки гриба. Впервые было показано, что применение видоспецифичных FITC-меченных антител в сочетании с PI позволило не только избирательно выявлять клетки патогена в многоклеточных смесях, но и точно дифференцировать живые клетки от мёртвых. Сравнение результатов ПЦМ и подсчёта КОЕ в моделируемых биологических образцах показало отсутствие статистически значимых различий между методами. Данный метод видится перспективной альтернативой общепринятым методам подсчёта КОЕ на ППС для определения количества живых клеток C. albicans при исследовании биологических образцов или определения эффективности антимикотических препаратов в культуре.

Оценивая перспективы практического применения ПЦМ для количественного определения живых клеток патогена в образцах, следует отметить, что данный метод имеет ряд ограничений. Как было показано в нашем исследовании, при анализе образцов, содержащих низкие концентрации C. albicans (менее 100 клеток на образец), метод демонстрирует значительные коэффициенты вариации и отклонения от расчётных значений. Это ограничение характерно и для других цитометрических подходов и связано со статистической достоверностью измерений при анализе малого числа событий [23]. В клинической практике аналогичные сложности возникают при анализе образцов крови с низкой грибной нагрузкой (≤ 1 КОЕ/мл). Для повышения достоверности результатов в таких случаях может потребоваться анализ большего объёма образца или использование нескольких повторностей. Высокая стоимость оборудования также может ограничивать широкое внедрение метода в рутинную лабораторную практику. Тем не менее развитие портативных и менее дорогостоящих цитометров, а также совершенствование протоколов окрашивания постепенно снижает эти барьеры.

Заключение

Полученные результаты свидетельствуют о том, что ПЦМ с использованием видоспецифичных антител и витальных красителей является высокоэффективным, быстрым и точным методом количественного определения живых клеток C. albicans как в чистой культуре, так и в многокомпонентных биологических образцах. Отсутствие альтернатив со сходными характеристиками делает предложенный метод особо востребованным для стандартизации образцов C. albicans в экспериментальных моделях кандидоза на лабораторных животных. Кроме того, метод может служить перспективной альтернативой традиционному подсчёту КОЕ при оценке эффективности антимикотических препаратов и при анализе биологических образцов в клинико-диагностических лабораториях.

Важно продолжить исследования, направленные на оценку применимости метода ПЦМ для других клинически значимых грибов, включая C. neoformans, C. auris, A. fumigatus, а также провести валидацию метода для анализа клинических образцов (кровь, моча, бронхоальвеолярный лаваж) в диагностике инвазивных микозов.

 

¹ The World Health Organization. WHO fungal priority pathogens list to guide research, development and public health action. 25 October 2022. URL: https://www.who.int/publications/i/item/9789240060241 (дата обращения: 13.05.2026).

² ГОСТ 33215-2014. Межгосударственный стандарт. Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила оборудования помещений и организации процедур.

About the authors

Amir I. Tukhvatulin

N.F. Gamaleya Federal Research Center for Epidemiology and Microbiology

Author for correspondence.
Email: amir_tuhvatulin@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-8506-2339

Cand. Sci. (Biol.), Head, Laboratory of mycoplasmas and L-form bacteria

Russian Federation, Moscow

Fatima M. Izhaeva

N.F. Gamaleya Federal Research Center for Epidemiology and Microbiology

Email: fatish-09@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-4110-3941

junior researcher, Laboratory of cellular microbiology

Russian Federation, Moscow

Alina Sh. Dzharullaeva

N.F. Gamaleya Federal Research Center for Epidemiology and Microbiology

Email: dzharullaeva@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-1743-0798

Cand. Sci. (Biol.), Head, Laboratory of cellular microbiology

Russian Federation, Moscow

Olga L. Voronina

N.F. Gamaleya Federal Research Center for Epidemiology and Microbiology

Email: olv550@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-7206-3594

Cand. Sci. (Biol.), Assistant Professor, Head, Laboratory of genome analysis

Russian Federation, Moscow

Marina S. Kunda

N.F. Gamaleya Federal Research Center for Epidemiology and Microbiology

Email: markunda99@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-1945-0397

Cand. Sci. (Biol.), senior researcher, Laboratory of genome analysis

Russian Federation, Moscow

Ekaterina I. Ermolova

N.F. Gamaleya Federal Research Center for Epidemiology and Microbiology

Email: aksenova16@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-0437-9404

Cand. Sci. (Biol.), senior researcher, Laboratory of genome analysis

Russian Federation, Moscow

Natalya N. Ryzhova

N.F. Gamaleya Federal Research Center for Epidemiology and Microbiology

Email: rynatalia@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-5361-870X

Cand. Sci. (Biol.), senior researcher, Laboratory of genome analysis

Russian Federation, Moscow

Alina S. Erokhova

N.F. Gamaleya Federal Research Center for Epidemiology and Microbiology

Email: erohova.alina95@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-2866-0329

junior researcher, Laboratory of cellular microbiology

Russian Federation, Moscow

Denis Yu. Logunov

N.F. Gamaleya Federal Research Center for Epidemiology and Microbiology

Email: logunov@gamaleya.org
ORCID iD: 0000-0003-4035-6581

Dr. Sci. (Biol.), Academician of RAS, Director

Russian Federation, Moscow

References

Supplementary files