Monoclonal antibodies to the B subunit of ricin: development and evaluation of potential applications for diagnostic and therapeutic purposes

Full Text

Введение

Рицин — высокотоксичный растительный белок, содержащийся в семенах клещевины обыкновенной (Ricinus communis). Рицин представляет собой гетеродимерный белок II типа, состоящий из ферментативной субъединицы A (RTA) и связывающей субъединицы B (RTB), соединённых дисульфидной связью. Токсин проникает в клетку путём рецептор-опосредованного эндоцитоза за счёт связывания RTB с терминальными остатками галактозы или N-ацетилгалактозамина на гликопротеиновых и гликолипидных рецепторах клеточной поверхности. После интернализации токсин транспортируется в аппарат Гольджи, где подвергается протеолизу с высвобождением RTA, обладающей N-гликозидазной активностью, которая удаляет специфический остаток аденина (А4324) из 28S рРНК, что приводит к необратимому ингибированию синтеза белка и гибели клетки [1, 2].

Существующая угроза использования рицина в качестве агента биотерроризма обусловлена его высокой токсичностью и относительно простыми методами экстракции токсина [3–5]. В связи с этим разработка высокочувствительных и специфичных методов детекции рицина в различных матрицах: биологических жидкостях для диагностики интоксикаций, а также в объектах окружающей среды и пищевых продуктах в рамках мониторинга биобезопасности, является актуальным направлением.

Для детекции рицина применяется множество подходов, включающих комплекс иммунохимических и масс-спектрометрических методов, а также биосенсорных технологий [6]. Иммунохимические методы детекции рицина в равной степени ориентированы на использование антител как к его каталитической субъединице RTA, так и к связывающей RTB. В наиболее распространённых форматах иммуноанализа классической стратегией является использование гетерологичной пары моноклональных антител (МКА), направленных против обеих субъединиц. Такой подход обеспечивает захват молекулы рицина через RTB и детекцию через RTA, что позволяет достичь высокой специфичности и чувствительности. J. Guo и соавт. разработали иммуноферментный анализ (ИФА) сэндвич-типа с использованием пары МКА: 3D74 к RTB и 4C13 к RTA для стандартного и быстрого форматов анализа [7]. Для иммуноэкстракции рицина и дальнейшего анализа с использованием масс-спектрометрических платформ используются МКА, специфичные к RTB, что позволяет эффективно захватывать и концентрировать токсин из сложных образцов (кровь, молоко, вода) с помощью магнитных частиц или сефарозы [8, 9]. МКА к RTB находят применение в разработке биосенсоров поверхностного плазмонного резонанса (SPR) для детекции рицина. М. Cummins и соавт. охарактеризовали панель из 6 МКА, которые были успешно переформатированы в рекомбинантные Fab-фрагменты, что открывает возможности для их интеграции в портативные детектирующие устройства [10].

В мире разработаны иммунохроматографические тест-системы (SMART-II, BioThreat Alert и др.), способные детектировать широкий спектр биологических агентов, включая рицин. В России единственным зарегистрированным и серийно выпускаемым медицинским изделием является мультианалитное иммунохроматографическое устройство для детекции биопатогенов токсинной природы, включая рицин, разработанное Государственным НИИ биологического приборостроения ФМБА России [4]. Другие отечественные сертифицированные иммунохроматографические тест-системы для экспресс-детекции рицина, сравнимые по аналитическим характеристикам с зарубежными аналогами, отсутствуют. В Институте молекулярной биологии РАН им. В.А. Энгельгардта разработаны белковые иммуночипы для мультиплексной детекции 6 токсинов, включая рицин, однако они пока не внедрены в практику [11].

На протяжении длительного времени в международной практике отсутствовали эффективные методы специфической профилактики и лечения отравлений рицином. В 2026 г. во Франции был зарегистрирован рицимед — первый в мире препарат для лечения острой интоксикации рицином¹. Рицимед разработан на основе поликлональных антител лошади, а именно F(ab')₂-фрагментов. Данная технология позволяет быстро получить безопасный и эффективный препарат, но уступает в периоде полувыведения и потенциальной эффективности препаратам на основе химерных и гуманизированных антител из-за удаления Fc-фрагмента. Исследования на мышах показывают, что полноразмерные антитела (с Fc-фрагментом) защищают организм от рицина значительно лучше, чем F(ab')₂-фрагменты, несмотря на то что в тестах in vitro их эффективность в нейтрализации токсина сопоставима [12].

МКА к RTB также представляют особый интерес в контексте разработки средств пассивной иммунотерапии. Нейтрализующие антитела к RTB способны блокировать связывание токсина с клеточными рецепторами, предотвращая его интернализацию. В работе C.R. McGuinness и соавт. показано, что МКА 24B11, специфичное к RTB, превосходило по нейтрализующей активности высокоаффинное антитело к RTA R70 в тестах на клетках Vero В, хотя их константы диссоциации (K_D) были сопоставимы. Кроме этого, использование комбинации антител к RTA и RTB приводило к их синергизму в нейтрализации рицина, что указывает на возможность разработки комбинированных иммунотерапевтических препаратов [13]. В литературе также описаны 2 МКА, специфичные к RTB: химерное антитело JB4 и гуманизированное антитело hD9. На стадии доклинических исследований оба антитела продемонстрировали 100% защиту мышей при введении через 4 ч после отравления (JB4) и при профилактическом введении (hD9) [14, 15].

Несмотря на присутствие на рынке России зарегистрированной тест-системы, позволяющей, наряду с другими токсинами, обнаруживать рицин, лимит детекции в 80 нг/мл может оказаться недостаточным в условиях реального применения, поскольку полулетальная доза для взрослого человека при пероральном применении составляет примерно 20 мкг/кг, при ингаляционной интоксикации — 3–5 мкг/кг, а при инъекционном пути летальные дозы значительно ниже за счёт большой биодоступности рицина [16]. Исходя из этих данных, по-прежнему существует необходимость снижения пределов обнаружения рицина с применением простых, доступных и быстрых в исполнении диагностических тестов.

При наличии многих описанных в научных работах антител, способных нейтрализовать рицин в кровотоке, до недавнего времени не было ни одного зарегистрированного терапевтического препарата для лечения рициновой интоксикации. Зарегистрированный в 2026 г. рицимед представляет собой F(ab')₂-фрагменты гетерологичных антител. Такой препарат при всей его эффективности не лишён основного недостатка любых гетерологичных иммуноглобулинов, вводимых человеку, — высокого риска иммуногенности. К тому же на российском рынке данный препарат не представлен.

Таким образом, получение высокоэффективных МКА для разработки отечественных диагностических тест-систем и препаратов на основе химерных и гуманизированных антител для специфической профилактики и лечения интоксикаций рицином остаётся актуальной задачей для обеспечения готовности к потенциальным биотеррористическим угрозам, а также для диагностики и терапии бытовых отравлений рицином.

Цель исследования — получение и характеристика мышиных МКА, специфичных к субъединице В рицина.

Материалы и методы

Получение рекомбинантной субъединицы B рицина и нативного рицина

Рекомбинантный белок RTB (аминокислотные остатки A 345–F 606 по базе данных NCBI Sequence ID: XP_048233460.1) с C-концевым тройным Myc-тэгом и 8xHis полигистидином был получен в эукариотической системе экспрессии с использованием суспензионной линии клеток яичника китайского хомячка CHO-S.

Нативный рицин выделяли из семян Ricinus communis по методике [17]. Очистку рицина выполняли на колонке «CHT5-1-11621» («Bio-Rad»), элюцию белка — в линейном градиенте 10–300 мМ фосфатного буфера pH 6,8.

Лабораторные животные

Для иммунизации и наработки стабильных гибридом в асцитной жидкости были использованы мыши инбредной линии BALB/с (H2d). Масса мышей составляла 18–20 г, возраст — 6–8 нед. Для проведения исследований по оценке нейтрализующей активности антител в тестах in vivo были использованы аутбредные мыши. Масса мышей составляла 18–22 г, возраст 8–14 нед. Животные были получены из питомника лабораторных животных (филиал «Столбовая» НЦБМТ ФМБА России). Все стадии исследования соответствовали законодательству Российской Федерации², Директиве Европейского парламента и Совета Европейского союза по охране животных, используемых в научных целях³. Протокол исследования одобрен Комиссией по биоэтике ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии (протокол № ВП-2024/9 от 24.12.2024).

Мышей содержали в клетках типа «микроизолятор» в контролируемых условиях окружающей среды (температура воздуха 20–24°С, относительная влажность 35–40%, освещение в помещениях — искусственное, с фиксированным режимом «день–ночь»). В качестве подстила использовали древесные опилки нехвойных пород, в качестве корма — стандартный комбикорм гранулированный полнорационный для лабораторных животных (экструдированный) ПК-120 ГОСТ 50258-92 («Лабораторкорм»).

Получение и очистка моноклональных антител

МКА получали с использованием классической гибридомной технологии, используя в качестве антигена для иммунизации мышей рекомбинантный белок RTB и миеломную клеточную линию Sp2/0-Ag14 в качестве клеток-партнёров для слияния.

В качестве антигенной эмульсии для иммунизации одной группы лабораторных животных использовали полный адъювант Фрейнда («Sigma-Aldrich»), смешанный в объёмном соотношении 1 : 1 с рекомбинантным белком RTB. Для другой группы животных использовали «Magic Mouse Adjuvant» («Creative Diagnostics») в количестве 50 мкг/мышь как для слабых иммуногенов. Для иммунизации одного животного использовали 100 мкг белка. Антиген вводили внутримышечно в основание хвоста в случае с адъювантом «Magic Mouse Adjuvant» и внутрибрюшинно в случае с адъювантом Фрейнда. Группа с адъювантом «Magic Mouse Adjuvant» проходила по короткому протоколу иммунизации из-за быстрой продукции высоких титров МКА — в течение 3 нед в 2 шага, а группа с адъювантом Фрейнда — по классическому протоколу, где добавлялся дополнительный шаг с иммунизацией мышей неполным адъювантом Фрейнда 1 раз в 3 нед. Бустерную дозу антигена животным вводили внутривенно без добавления адъюванта за 3 дня до слияния.

Гибридизацию проводили с помощью системы для электрослияния клеток, состоящей из генератора электрических импульсов «BTX ECM 2001» («BTX») и микрослайда «Model 453» («Harvard Bioscience»). Скрининг, клонирование и накопление гибридом в асцитной жидкости, а также очистку антител проводили, как описано ранее [18]. Анализ чистоты МКА проводили методом электрофоретического разделения в полиакриламидном геле (ПААГ).

Определение специфичности МКА

Специфичность полученных МКА в отношении рицина оценивали методом вестерн-блоттинга [19]. Для этого рицин подвергали разделению в 10% ПААГ с последующим переносом на нитроцеллюлозную мембрану («GE Water&Technologies»). Электрофоретическое разделение проводили в восстанавливающих (с добавлением β-меркаптоэтанола) и невосстанавливающих условиях. Неспецифическое связывание блокировали 0,5% обезжиренным молоком в течение 1 ч при 37°С. Для промывок мембран на каждом этапе использовали фосфатно-солевой буфер (рН 7,4) с 0,05% Твин-20 (ФСБ-Тв). Первичными антителами служили исследуемые МКА в концентрации 10 мкг/мл. В качестве вторичных антител использовали пероксидазный конъюгат к суммарной фракции IgG мыши («Sigma») в рабочем разведении 1 : 10 000. Визуализацию реакции проводили с использованием субстратной смеси на основе диаминобензидина («Sigma»).

Определение силы аффинного взаимодействия

Определение равновесной K_D антител проводили при помощи SPR-анализа на приборе «Biacore X-100» («Cytiva») [10]. В качестве буфера на всех этапах исследования использовали HBS-EP (10 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, 3 мМ ЭДТА, 0,05% Tвин-20, рН 7,4). Использовали чип CM5 («Cytiva») с химически пришитыми на поверхности декстрана антигистидиновыми антителами, которые в анализе связываются с полигистидиновым тэгом в составе RTB рицина. Антигистидиновые антитела иммобилизировали на поверхности чипа при помощи набора «His Capture Kit, Type 2» («Cytiva»). В качестве лиганда использовали RTB в концентрации 5 мкг/мл, аналитом выступали исследуемые МКА к B-субъединице рицина в диапазоне концентраций 50–800 нМ с двукратным шагом разведения. Регенерацию проводили 10 мМ раствором глицина с pH 1,5. Сенсограммы анализировали при помощи программного обеспечения «Biacore X-100 Evaluation Software» («Biacore»).

Выбор оптимальной пары МКА для детекции RTB

Сначала при помощи сэндвич-ИФА подбирали пары МКА, способные детектировать RTB в таком формате анализа. При проведении сэндвич-анализа каждое МКА тестировали в комбинации со всеми МКА полученной панели для выявления пар, способных обнаруживать RTB. В качестве захватывающего антитела использовали немеченное МКА, в качестве детектирующего — биотинилированную форму.

Для этого все клоны МКА были конъюгированы с биотином с использованием биотин-сукцинимидного эфира («Sigma») по методу [22] с 50-кратным молярным избытком биотинового реагента. Концентрацию биотинилированных антител довели до 1 мг/мл.

Планшеты покрывали не меченными биотином МКА в концентрации 0,1 мкг/мл (8 МКА из 13) или 10 мкг/мл (5 МКА из 13) МКА в ФСБ (pH 7,4) и инкубировали в течение 1 ч при 37°C. Концентрацию МКА для иммобилизации на поверхность лунок выбирали, исходя из результатов титровки МКА в прямом ИФА. Свободные сайты связываний на поверхности пластика блокировали добавлением в каждую лунку по 160 мкл обезжиренного (0,5%) молока. После отмывки лунок планшета ФСБ-Тв добавляли раствор RTB в концентрации 10 мкг/мл в ФСБ, инкубировали в течение 1 ч при 37°С. Затем лунки планшета снова отмывали и добавляли раствор биотинилированного МКА в ФСБ в разведении 1 : 400, инкубировали в течение 1 ч при 37°C. После каждой инкубации планшет отмывали 4 раза с использованием раствора ФСБ-Тв. Далее вносили конъюгат стрептавидин–пероксидаза хрена («Имтек») в рабочем разведении 1 : 10 000 и инкубировали в течение 40 мин в тех же условиях, затем 6-кратно отмывали ФСБ-Тв. После этого в лунки вносили по 100 мкл проявочного раствора на основе TMB («Bio-Rad»). Реакцию оценивали по появлению синего окрашивания раствора, останавливали развитие реакции добавлением 50 мкл 4N H₂SO₄. Оптическую плотность раствора в лунках измеряли на планшетном спектрофотометре «xMark» («Bio-Rad») при длине волны 450 нм.

После выбора оптимальных парных комбинаций захватывающего и детектирующего МКА проводили сэндвич-ИФА для определения наиболее чувствительной диагностической пары, способной выявлять минимальные количества рицина.

Не меченные биотином МКА в ФСБ (рН 7,4) с начальной концентрацией 10 мкг/мл титровали двукратным шагом по горизонтали до конечной концентрации 0,038 мкг/мл (по 100 мкл/лунку в ФСБ). Планшет с антителами инкубировали в течение 1 ч на шейкере при 37°С, затем 4 раза промывали ФСБ-Тв. Участки неспецифического связывания блокировали добавлением в лунки по 160 мкл молока 0,5% жирности, инкубировали в течение 1 ч на шейкере при 37°С и промывали 3 раза ФСБ-Тв. RTB титровали двукратным шагом по вертикали с начальной концентрацией 5 мкг/мл до конечной концентрации 0,038 мкг/мл в ФСБ (по 100 мкл/лунку), инкубировали при тех же условиях, после чего промывали планшет 4 раза в ФСБ-Тв. В качестве контроля использовали лунки без добавления антигена. Биотинилированные МКА вносили заведомо в избытке (разведение 1 : 400 ) по 100 мкл/лунку в ФСБ, инкубацию и промывку планшета проводили 4-кратно, как описано выше. Затем в лунки планшета добавляли по 100 мкл конъюгата стрептавидин–пероксидаза хрена («Имтек») в разведении 1 : 10 000 в ФСБ. После инкубации и 4-кратной отмывки планшета в лунки вносили по 100 мкл проявочного раствора на основе TMB. Планшет помещали на 3–5 мин в защищённое от света место при комнатной температуре, затем останавливали реакцию 4N H₂SO₄ (50 мкл/лунку). Учёт результатов проводили с помощью планшетного спектрофотометра «xMark» («Bio-Rad») при длине волны 450 нм.

Определение токсиннейтрализующей активности МКА в тесте in vitro

Оценку цитотоксичности рицина и токсиннейтрализующей активности полученных МКА проводили на клеточной линии Vero В (ГКПМ-Оболенск, коллекционный номер H-98) с использованием МТТ-теста [23]. Клетки Vero В культивировали в среде DMEM («Gibco»), содержащей 10% эмбриональную бычью сыворотку («Gibco») и антибиотик-антимикотик («Biosera»), в инкубаторе во влажной атмосфере при 37°С и 5% CO₂. Далее клетки в концентрации 10 000 клеток/лунку высевали в 96-луночные планшеты в объёме 100 мкл среды и культивировали в течение ночи.

Для определения полумаксимальной ингибирующей концентрации (IC₅₀) рицина в культуральные планшеты с клетками вносили рицин в объёме 100 мкл в диапазоне концентраций от 1,5 нг/мл с двукратным шагом разведения до 10 пг/мл. Планшеты инкубировали в течение 48 ч в CO₂-инкубаторе.

Для оценки нейтрализующей способности МКА титровали с двукратным шагом разведения и исходной концентрацией 2,5 мкг/мл в объёме 50 мкл. Затем во все лунки вносили рицин в объёме 50 мкл на лунку в концентрациях, равных значениям IC₅₀ и 8 × IC₅₀. Данную смесь инкубировали в течение 1 ч при 37 °С и далее вносили в культуральные планшеты к клеткам. Планшеты инкубировали в течение 48 ч в CO₂-инкубаторе.

Во всех экспериментах в качестве контроля, соответствующего 100-процентной выживаемости клеток (К1), использовали интактные лунки с клетками в полной ростовой среде. В качестве контроля, соответствующего 100-процентной гибели клеток (К2), использовали лунки с клетками с добавлением раствора 0,024% мертиолята натрия. По окончании инкубации в каждую лунку вносили 10 мкл раствора МТТ («Sigma-Aldrich») с концентрацией 5,0 мг/мл. Планшеты инкубировали в тех же условиях в течение 4 ч. После инкубации образовавшиеся кристаллы формазана растворяли в 100 мкл диметилсульфоксида («Sigma-Aldrich») в течение 15 мин. Оптическую плотность (ОП) измеряли при 540 нм на микропланшетном ридере «xMark» («Bio-Rad»). Жизнеспособность клеток рассчитывали по формуле:

$\mathrm{Жизнеспособность} \text{(}\%\text{)} =\frac{\mathrm{ОП}\left(\mathrm{образца}\right) – \mathrm{ОП}\left(\mathrm{К}2\right)}{\mathrm{ОП}\left(\mathrm{К}1\right) – \mathrm{ОП}\left(\mathrm{К}2\right)}\times 100$.

Определение токсиннейтрализующей активности МКА в тесте in vivo

Значение полулетальной дозы (ЛД₅₀) рицина для аутбредных мышей при внутрибрюшинном введении рассчитывали по методу пробит-анализа. Для этого мышам внутрибрюшинно вводили раствор рицина в ФСБ в объёме 0,5 мл в следующих дозах: 235; 47; 9; 1,9 мкг/кг.

Изучение протективной эффективности полученных МКА проводили на модели острой интоксикации рицином с превентивным введением антител. Мышам (по 6 голов в группе) внутривенно вводили раствор объёмом 0,2 мл МКА в дозе 100 мкг/мышь. После введения МКА с интервалом 60 мин животным вводили рицин внутрибрюшинно в дозе 3 × ЛД₅₀. В качестве контроля были использованы две группы животных: 1-я группа (контроль летальности), которой вводили только рицин в дозе 3 × ЛД₅₀; 2-я группа (контроль выживаемости), которой вводили стерильный ФСБ.

Во всех экспериментах за животными наблюдали и учитывали гибель в течение 14 дней. После окончания эксперимента выжившие животные были подвергнуты эвтаназии.

Статистическая обработка данных

Статистический анализ и репрезентативные графики были выполнены с использованием «GraphPad Prism 8.0» («GraphPad Software»). Значение IC₅₀ рицина рассчитывали методом нелинейной регрессии. Кривые ингибирования строили с использованием уравнения логарифмической зависимости (ингибитора) от нормализованного ответа с переменным наклоном и аппроксимацией методом наименьших квадратов. Результаты выражали как среднеарифметическое ± стандартное отклонение. Протективную эффективность оценивали по методу Каплана–Майера. Различия считали значимыми при p ≤ 0,05.

Результаты

Получение и определение специфичности МКА

В результате гибридизации и последующей селекции было получено 13 стабильных гибридомных линий, продуцирующих специфические МКА класса IgG. После двухэтапной очистки (аффинная хроматография и гель-фильтрация) полученные МКА были выделены из асцитической жидкости мышей и использовались для дальнейших исследований. Электрофоретический анализ выделенных иммуноглобулиновых фракций подтвердил высокую степень чистоты полученных препаратов МКА (рис. 1, а). В редуцирующих условиях МКА денатурировали на лёгкую и тяжёлую цепи с молекулярными массами 25 и 50 кДа соответственно. Результаты определения специфичности полученных МКА методом вестерн-блоттинга представлены на рис. 1, б, в на примере МКА RTB-F2-10. Анализ полученных результатов показал, что все 13 МКА специфично взаимодействуют с RTB.

 

Рис. 1. Результаты электрофореза и вестерн-блоттинга на примере МКА RTB-F2-10. а — пример электрофоретического разделения МКА в 10% ПААГ в денатурирующих условиях: 1 — «Spectra Multicolor» («Broad Range Protein Ladder»); 2 — образец МКА RTB-F2-10; 3 — образец МКА RTB-F5-1. б — специфическая активность МКА RTB-F2-10 по отношению к нативному полноразмерному рицину в неденатурирующих условиях: 1 — «Spectra Multicolor»; 2 — полноразмерный нативный рицин, связавшийся с образцом МКА RTB-F2-10. в — специфическая активность МКА RTB-F2-10 по отношению к нативному рицину в денатурирующих условиях: 1 — «Spectra Multicolor»; 2 — денатурированный нативный рицин с образцом антитела RTB-F2-10, связавшегося с В-субъединицей.

 

Определение равновесной константы диссоциации МКА

Величины K_D определяли методом SPR. Расчётные значения K_D представлены в таблице. Полученные результаты позволяют заключить, что наилучшие показатели K_D имеют следующие МКА: RTB-F2-15, RTB-F2-13, RTB-F5-1, RTB-F1-2, RTB-MM2-2 и RTB-F1-15.

 

Величины K_D, определённые методом SPR

МКА	KD, М
RTB-F1-2	3,69 × 10–7
RTB-F1-5	3,01 × 10–5
RTB-F1-10	3,25 × 10–6
RTB-F1-12	7,24 × 10–7
RTB-F1-15	3,50 × 10–7
RTB-F1-16	2,45 × 10–6
RTB-F2-3	1,60 × 10–6
RTB-F2-10	7,37 × 10–7
RTB-F2-13	1,13 × 10–7
RTB-F2-15	6,30 × 10–8
RTB-F2-16	5,62 × 10–5
RTB-F5-1	4,94 × 10–7
RTB-MM2-2	1,53 × 10–7

 

Выбор оптимальной пары МКА для детекции RTB

Первично удалось выявить 6 комбинаций МКА, способных выявлять RTB в формате сэндвич-ИФА. Данные комбинации были исследованы далее для определения порога чувствительности.

Наибольшая чувствительность теста в формате сэндвич-ИФА (детекция 9,5 нг/мл RTB, что соответствует 18,5 нг/мл полноразмерного рицина) была достигнута при использовании следующих пар МКА: 1) RTB-F5-1 + RTB-F1-2; 2) RTB-F2-10 + RTB-F1-2. Ещё 2 пары позволили уверенно детектировать до 19 нг/мл RTB: 1) RTB-F2-10 + RTB-F1-16; 2) RTB-F1-16 + RTB-F1-2. Предел детекции для пары RTB-F1-2 + RTB-F1-2 составил 38 нг/мл RTB, а для пары RTB-MM2-2 + RTB-F1-2 — 75 нг/мл RTB.

Оценка токсиннейтрализующей активности МКА в тесте in vitro

Анализ нейтрализующих свойств МКА в отношении рицина проводили в экспериментах in vitro на клеточной линии Vero В. На первом этапе исследования было установлено, что IC₅₀ рицина для клеток Vero составляет 400 пг/мл (рис. 2).

 

Рис. 2. Результаты определения IС₅₀ рицина для клеточной линии Vero В.

 

На следующем этапе исследования оценивали потенцирующую способность исследуемых МКА за счёт усиления токсического действия рицина (рис. 3). Установлено, что все исследуемые МКА проявляют выраженную нейтрализующую активность в отношении рицина в дозе IC₅₀, о чём свидетельствовало сохранение жизнеспособности клеточного монослоя в диапазоне 50–100% по сравнению с контрольной группой без антител.

 

Рис. 3. Оценка потенцирующей способности МКА на клеточной линии Vero В.

 

Далее для выявления токсиннейтрализующей способности МКА на клеточной линии Vero В нагрузка рицина была увеличена до 8-кратного значения IC₅₀ (8 × IC₅₀) и была равна 3200 пг/мл (3,2 нг/мл) (рис. 4).

 

Рис. 4. Определение токсиннейтрализующей активности МКА на клеточной линии Vero B при нагрузке 8 × IС₅₀ рицина.

 

В условиях повышенной токсической нагрузки было показано, что 4 анализируемых МКА сохраняли способность к нейтрализации рицина и предотвращали развитие цитотоксического эффекта на клетках Vero В. Полученные данные указывают на наличие функционально различающихся антител по степени нейтрализации, что не всегда коррелирует с их активностью, выявляемой при тестировании в диапазоне IC₅₀ (400 пг/мл).

Таким образом, хотя все исследованные клоны МКА демонстрировали нейтрализующую активность в формате оценки при IC₅₀, последующее тестирование в усиленных условиях токсичности (8 × IC₅₀) позволило однозначно выделить высокоэффективные нейтрализующие антитела. МКА RTB-F2-10, RTB-F1-15, RTB-F1-16, RTB-F5-1 характеризуются устойчивой антитоксической активностью при повышенной концентрации рицина и поэтому могут рассматриваться как перспективные кандидаты для дальнейшего терапевтического и/или профилактического применения, а также для последующей валидации по расширенному набору функциональных параметров.

Оценка нейтрализующей активности МКА в отношении рицина на животных

Для установления терапевтической значимости МКА, показавших токсиннейтрализующий эффект in vitro, были проведены исследования на мышах, позволяющие учесть сложность целостной биологической системы (рис. 5).

 

Рис. 5. Определение токсиннейтрализующей активности МКА на модели аутбредных мышей.

 

Рассчитанная методом пробит-анализа доза ЛД₅₀ для аутбредных мышей составила 26,5 мкг/кг, доза 3 × ЛД₅₀ — 80 мкг/кг.

Результаты, отображённые на графике, демонстрируют динамику выживаемости особей в зависимости от времени наблюдения. В представленной модели для подавления токсичности рицина наиболее выраженный защитный эффект наблюдается для антител RTB-F2-10, RTB-F1-15 и RTB-F5-1, сопровождающийся максимальными показателями выживаемости 66–100%. Антитело RTB-F1-16 обладает низкой токсиннейтрализующей эффективностью по сравнению с остальными исследованными МКА.

Обсуждение

Необходимость повышения эффективности ранней диагностики рицинового отравления обусловлена кратковременностью циркуляции токсина в крови и других биологических средах, что связано с его интенсивным метаболизмом и быстрым снижением концентрации в первые часы после экспозиции. Использование МКА к рицину позволяет существенно повысить чувствительность и аналитическую надёжность иммуноанализов, сократить время проведения исследования и обеспечить стандартизацию протоколов.

Была получена панель из 13 МКА, специфичных к В-субъединице рицина. В соответствии с данными SPR-анализа K_D антител RTB-F2-15, RTB-F2-13, RTB-F5-1, RTB-F1-2, RTB-MM2-2 и RTB-F1-15 находятся в наномолярном диапазоне, что свидетельствует о стабильном связывании МКА с целевыми молекулами даже в низких концентрациях, что особенно важно при детекции токсинов в сложных пробах.

В результате подбора диагностических пар МКА установлено, что 6 пар МКА позволяют детектировать RTB, но обладают разной чувствительностью. Только 2 пары (RTB-F5-1 + RTB-F1-2 и RTB-F2-10 + RTB-F1-2) позволяют выявить до 9,5 нг/мл RTB (18,5 нг/мл полноразмерного рицина). Прочие пары обладали меньшей чувствительностью в диапазоне 19,0–75,0 нг/мл RTB (37,0–146 нг/мл полноразмерного рицина соответственно). Выбранные диагностические пары обладают чувствительностью, сопоставимой с присутствующим на российском рынке мультианалитным иммунохроматографическим устройством для выявления токсинов производства ФГУП «ГосНИИБП» ФМБА России и зарубежными тест-системами [4]. Во всех эффективных диагностических парах детектирующее биотинилированное МКА было представлено именно антителом RTB-F1-2. Дальнейшая оптимизация теста в сэндвич-формате, вероятно, позволит увеличить чувствительность детекции рицина посредством узнавания RTB.

Антитела, связываясь с рицином, могут как снижать его токсический эффект, так и в некоторых случаях потенцировать [24]. В эксперименте in vitro был изучен возможный потенцирующий эффект МКА, приводящий к усилению цитотоксичности рицина в дозе IC₅₀ в смеси с исследуемыми антителами. По результатам проведённых экспериментов нами не были выявлены МКА, проявляющие способность к усилению токсичности рицина в условиях эксперимента.

В ходе исследования токсиннейтрализующего потенциала МКА в тесте in vitro установлено, что большинство антител исследованной панели проявили выраженную токсиннейтрализующую активность в отношении рицина в дозе IC₅₀. Для исключения потенциальных ложноположительных результатов, демонстрирующих токсиннейтрализующий эффект при воздействии низкой дозы рицина, были проведены дополнительные исследования с использованием дозы 8 × IC₅₀. Антитела, которые сохраняли выраженную нейтрализующую активность (RTB-F2-10, RTB-F1-15, RTB-F1-16, RTB-F5-1), были классифицированы как высокоэффективные нейтрализующие и рекомендованы для дальнейших исследований.

На следующем этапе исследования был изучен протективный эффект полученных МКА в тесте in vivo на модели острой интоксикации рицином с превентивным введением антител. Применение МКА RTB-F2-10 обеспечивало 100% защиту животных от токсического действия рицина в дозе 3 × ЛД₅₀. Менее выраженным протективным эффектом обладали МКА RTB-F1-15 и RTB-F5-1. МКА RTB-F1-16, продемонстрировавшие выраженную нейтрализующую активность в тесте in vitro, показали низкую эффективность на мышиной модели. Данный факт легко объясняется тем, что в живом организме на нейтрализующую эффективность антитела существенно влияют фармакокинетика и биораспределение самого антитела, иммунологические и патофизиологические механизмы (воспаление, цитокиновый ответ, Fc-зависимые эффекторные функции), происходящие в организме, влияние которых невозможно оценить в тесте in vitro на уровне клетки, что является ограничением тестов на клеточных линиях.

По результатам исследований было обнаружено, что, несмотря на высокий показатель K_D МКА RTB-F2-15, данное антитело не обладало диагностическим и токсиннейтрализующим потенциалом. Это явление также описано в литературе для некоторых антигенов, включая такие токсины, как рицин и сибиреязвенные токсины [25, 26]. Полученные нами данные демонстрируют необходимость подтверждения функциональной активности антитела в выбранном формате.

Заключение

На основании полученных экспериментальных данных определены две диагностические пары: МКА RTB-F5-1 + RTB-F1-2 и RTB-F2-10 + RTB-F1-2, наиболее перспективные для дальнейшего конструирования диагностических тест-систем в сэндвич-формате.

Профилактическое введение МКА RTB-F2-10 обеспечивает полную защиту мышей от гибели при интоксикации рицином в дозе 3 × ЛД₅₀, что позволяет рассматривать эти МКА в качестве перспективного кандидата для разработки препарата с целью специфической профилактики и/или терапии отравлений рицином. Таким образом, гибридома-продуцент МКА RTB-F2-10 представляет основу для дальнейшего конструирования химерного или гуманизированного вариантов антитела, что откроет перспективы для создания препарата, предназначенного для профилактики и/или лечения интоксикации рицином.

 

¹ Fabentech. Fabentech receives marketing authorization for Ricimed, an antidote against ricin poisoning. 2026. URL: https://www.fabentech.com/en/fabentech-receives-marketing-authorization-for-ricimed-an-antidote-against-ricin-poisoning/ (дата обращения 01.06.2026).

² Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 19.06.2003 № 267 «Правила лабораторной практики в Российской Федерации».

³ Directive 2010/63/EU of the European Parliament and of the Council of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes. 20.10.2010, L 276, 33–79. URL: https://eur-lex.europa.eu/legal-content/EN/TXT/?uri=CELEX:32010L0063

About the authors

Irina S. Lutcheva

State Research Center for Applied Microbiology and Biotechnology

Email: ira.gravdan2809@gmail.com
ORCID iD: 0009-0005-1829-7871

junior researcher, Molecular biology laboratory

Russian Federation, Obolensk

Metkhun M. Rogozin

State Research Center for Applied Microbiology and Biotechnology

Email: rogozin666@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-3361-3263

junior researcher, Molecular biology laboratory

Russian Federation, Obolensk

Natalia A. Zeninskaya

State Research Center for Applied Microbiology and Biotechnology

Email: nataliazeninskaya@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-5388-292X

researcher, Molecular biology laboratory

Russian Federation, Obolensk

Alyona S. Kartseva

State Research Center for Applied Microbiology and Biotechnology

Email: kartseva_as@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-3159-6439

Cand. Sci. (Biol.), senior researcher, Molecular biology laboratory

Russian Federation, Obolensk

Tatyana A. Ivashchenko

State Research Center for Applied Microbiology and Biotechnology

Email: ivaschenko@obolensk.org
ORCID iD: 0000-0002-4908-2524

Cand. Sci. (Biol.) researcher, Molecular biology laboratory

Russian Federation, Obolensk

Alyona K. Ryabko

State Research Center for Applied Microbiology and Biotechnology

Email: ryabko_alena@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-7478-909X

researcher, Molecular biology laboratory

Russian Federation, Obolensk

Anastasia A. Ershova

State Research Center for Applied Microbiology and Biotechnology

Email: anastasiia.yershova@mail.ru
ORCID iD: 0009-0002-0463-7925

junior researcher, Molecular biology laboratory

Russian Federation, Obolensk

Alexander I. Borzilov

State Research Center for Applied Microbiology and Biotechnology

Email: borzilov@obolensk.org
ORCID iD: 0000-0001-6309-7645

Cand. Sci. (Med.), eading researcher, Laboratory of biological testing

Russian Federation, Obolensk

Evgeniya S. Pereskokova

State Research Center for Applied Microbiology and Biotechnology

Email: pereskokova@obolensk.org
ORCID iD: 0009-0009-0629-1519

junior researcher, Laboratory of biological testing

Russian Federation, Obolensk

Olga V. Korobova

State Research Center for Applied Microbiology and Biotechnology

Email: korobova@obolensk.org
ORCID iD: 0000-0002-7068-3236

Cand. Sci. (Biol.), senior researcher, Laboratory of biological testing

Russian Federation, Obolensk

Victoria V. Firstova

State Research Center for Applied Microbiology and Biotechnology

Author for correspondence.
Email: firstova@obolensk.org
ORCID iD: 0000-0002-9898-9894

Dr. Sci. (Biol.), chief researcher, Molecular biology laboratory

Russian Federation, Obolensk

References

Supplementary files