Construction of recombinant attenuated Bordetella pertussis bacteria of the ptxP3-ptxA1-fim3-2-fim2-2 genotype

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Бактерии Bordetella pertussis являются этиологическим агентом коклюша – контагиозного респираторного инфекционного заболевания, характеризующегося тяжелыми повторяющимися приступами кашля и являющегося причиной развития осложнений и летальных исходов у младенцев [1-4]. Несмотря на то, что коклюш традиционно считается детским заболеванием, в последние годы растет число случаев его выявления у подростков и взрослых, в том числе в тяжёлых формах, особенно в странах, где цельноклеточные коклюшные вакцины (ЦКВ) заменили на бесклеточные коклюшные вакцины (БКВ) [4]. Коклюш представляет серьезную угрозу для здоровья взрослых, в ряде случаев способную привести к летальным исходам. Заболевание значительно снижает качество жизни, особенно у пожилых пациентов, страдающих хроническими соматическими заболеваниями, и влечет за собой существенные финансовые затраты на лечение [4]. Так, в Португалии среди детей младше 1 года, госпитализированных с коклюшем, коэффициент летальности (CFR) составил 0,8%. Среди взрослых пациентов с коклюшем CFR был значительно выше: 11,5% для лиц в возрасте 18-64 лет и 17,4% для лиц старше 65 лет [4]. При этом, согласно исследованиям, проведенным в США, эффективность диагностики коклюша остается крайне низкой, не превышая 10-15%. Рост заболеваемости коклюшем среди взрослого населения является предметом серьезной обеспокоенности. В частности, смещение возрастного пика заболеваемости в сторону женщин детородного возраста потенциально повышает риск передачи инфекции новорожденным не иммунизированным младенцам [4].

Рост заболеваемости коклюшем среди детей и взрослых обуславливает актуальность проведения массовой ревакцинации населения всех возрастных групп. Однако в настоящее время стратегии ревакцинации для взрослых не разработаны даже в государствах с высоким уровнем жизни. К концу 1990-х годов большинство экономически развитых стран перешли с ЦКВ на БКВ, поскольку последние считались менее реактогенными, чем ЦКВ составе препаратов АКДС. При этом АКДС продолжали активно использовать в странах с низким и средним уровнем дохода [5, 6]. Согласно последним данным, реактогенность ЦКВ оказалась несколько преувеличенной, а эффективность БКВ значительно уступает ЦКВ [6]. Защитный иммунитет после вакцинации БКВ сохраняется 3-5 лет, тогда как ЦКВ обеспечивает защиту на период от 4 до 12 лет. Самым долгосрочным остается иммунитет после перенесенного коклюша – от 10 до 20 лет [6]. В виду отсутствия напряженного иммунитета дети, привитые БКВ, остаются восприимчивыми к коклюшу, что приводит к снижению популяционного иммунитета и требует введения бустирующих доз вакцины (в 6-7 лет). При этом вакцинация и ревакцинация БКВ не разрывает цепь распространения инфекции и не обеспечивает защиту от повторного заражения, а лишь предотвращает развитие тяжелых форм заболевания, что также препятствует эффективному формированию коллективного иммунитета.

Среди основных причин роста заболеваемости коклюшем также выделяют адаптацию возбудителя, бактерий B. pertussis, позволяющую ему преодолевать иммунитет, индуцированный вакциной [6-13].

Изначально изменения генотипа бактерий B. pertussis, связанные с полиморфизмом, были описаны в генах, кодирующих белки, входящие в состав БКВ, в частности пертактина и коклюшного токсина (КТ). Дальнейшие исследования выявили полиморфизм в промоторе гена КТ (ptxР), а также в генах fim2 и fim3, ответственных за синтез фимбрий (агглютиногенов) [7-13]. Бактерии B. pertussis с исходными, довакцинными генотипами циркулируют параллельно с новыми вариантами или полностью вытеснены ими. Тип и состав коклюшных вакцин, применяемых в стране или регионе, оказывает существенное влияние на генетическое разнообразие циркулирующих штаммов B. pertussis [7-10]. Исследования показали значительный рост доли изолятов B. pertussis с генотипом ptxP3 в большинстве стран: с 5-20% в начале
1990-х годов до более 80% к середине 2000-х. К 2000-м годам генотип ptxA1 стал доминирующим, составляя свыше 90%. Распределение аллелей fim2 и fim3 демонстрирует географическую вариабельность, которая не всегда напрямую коррелирует с применяемой коклюшной вакциной. Так, в Польше в 2000-х годах наблюдалось приблизительно равное соотношение штаммов B. pertussis с генотипами fim2-1 и fim2-2. В то же время генотип fim3-1 преобладал над fim3-2. В других странах Европы соотношение генотипов fim3-1 к fim3-2 было близко к единице [7]. В Перу, где для вакцинации против коклюша применяют ЦКВ, наблюдается преобладание клинических изолятов B. pertussis с генотипом fim3-1. В то же время в Иране, Аргентине и Танзании, где также используют ЦКВ, доминирующим является генотип fim3-2 [10]. Исследования, проведённые в России, выявили значительные изменения в преобладании генотипов fim2-1: в 1950-х годах этот генотип встречался в 100% случаев, а к 1990-м годам его доля снизилась до 10%. Генотип fim3-2 в 1990-е годы составлял 60% исследованных образцов. В последние годы наблюдается дальнейшее усиление доминирования fim3-2: из 8 секвенированных геномов «новых» штаммов 6 имели этот генотип fim3-2 [11-13]. Для исследования аллельной изменчивости возбудителя коклюша выбирают гены, кодирующие ключевые протективные антигены, входящие в состав большинства используемых БКВ. Выбор генов также основывается на данных о повышенной продукции КТ изолятами, несущими промотор ptxP3 оперона ptx [7]. Исследователи полагают, что широкое внедрение БКВ, вероятно, привело к усилению селективного давления и ускорению мутагенеза генов возбудителя коклюша, что могло произойти из-за снижения антигенного разнообразия в составе вакцины [7, 8]. Сформулирована гипотеза, предполагающая что выявленная адаптационная изменчивость возбудителя коклюша снижает эффективность вакцин «старого» генотипа против циркулирующих бактерий B. pertussis «новых» генотипов. Однако экспериментальных подтверждений сформулированного утверждения в литературе не найдено.

С учетом имеющихся данных литературы можно рассчитывать, что включение в состав любой коклюшной вакцины бактерий или протективных антигенов «нового» генотипа, циркулирующего в современной популяции возбудителя коклюша, позволит повысить ее защитный потенциал и увеличить популяционный иммунитет против коклюша. В полной мере это относится к живым коклюшным вакцинам интраназального применения, разработанным в ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России (ГамЖВК) и в Институте Пастера в Лилле, Франция (BPZE1) [13 - 21]. Аттенуированные бактерии B. pertussis 4МKS, входящие в состав живой рекомбинантной вакцины ГамЖВК, имеют генотип ptxA4-ptxP3-fim2-2-fim3-1. Бактерии B. pertussis 4МKS сконструированы в результате модификации хромосомы B. pertussis 475 «старого» генотипа и содержат мутантный ген ptxA4, мутацию в области промотора ptxP3, мутацию, определяющую генотип fim2-2 и нокаутную мутацию в гене dnt [14]. Можно предположить, что увеличение защитного потенциала ГамЖВК, безопасность и эффективность которой подтверждена в клинических исследованиях с участием взрослых добровольцев, может быть достигнуто в результате совместного использования бактерий B. pertussis 4МKS и изогенных им аттенуированных бактерий «нового» генотипа. Сопоставление иммунобиологических характеристик двух изогенных бактерий разных генотипов позволит получить экспериментальные подтверждения сформулированной выше гипотезы о более низком защитном потенциале вакцин «старого» генотипа против бактерий возбудителя коклюша «нового» генотипа.

Целью настоящей работы является конструирование рекомбинантных бактерий B. pertussis «нового» генотипа, изогенных бактериям B. pertussis «старого» генотипа, и оценка их генетической стабильности.

 

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Штаммы бактерий, условия культивирования, фенотипическая характеристика бактерий и КОЕ.

Штаммы бактерий B. pertussis, E. coli и плазмиды представлены в таблице 1.

 

 

Таблица 1. Штаммы и плазмиды, использованные и сконструированные в работе

Table 1. Strains and plasmids employed and constructed in this study

Штамм Strain	Генотип /фенотип Genotype /phenotype		Происхождение Origin		Источник Source
B. pertussis 475	ptxР2, ptxА4 fim 2-1 fim3-1 dnt /SmRNalR СmRKmS1//1.2.3		Производственный (вакцинный) штамм Vaccine strain		НИЦЭМ G.C.
B. pertussis 284	ptxА1 fim 2-2 fim3-2//1.0.3		Клинический изолят Clinical isolate		[12]
B. pertussis А	ptx* А1::kan, dnt , fim 2-1, fim 3-1 / SmRNalR СmRKmS//1.2.3		Мутант B. pertussis 475 B. pertussis 475 mutant		н.р. d.r.
B. pertussis Д	ptx* А1::kan dnt::cat fim 2-1 fim 3-1 SmRNalR СmR//1.2.3		Мутант B. pertussis А B. pertussis А mutant		н.р. d.r.
B. pertussis Р	ptxР3 ptx* А1 dnt::cat fim 2-1 fim 3-1/ SmRNalR СmRKmS//1.2.3		Мутант B. pertussis Д B. pertussis Д mutant		н.р. d.r.
B. pertussis Ф2	ptxР3 ptx* А1 dnt::cat fim 2-2 fim 3-1/ SmRNalR СmRKmS//1.2.3		Мутант B. pertussis Р B. pertussis Р mutant		н.р. d.r.
B. pertussis 4MKK	ptxР3 ptx* А1 dnt::cat fim 2-2 fim 3-2/ SmRNalR СmR//1.2.3		Мутант B. pertussis Ф2 B. pertussis Ф2 mutant		н.р. d.r.
E. coli Sm 10	recA, RP4:2-Tc::Mu aph:: Tn7 pir/ KmR		-		НИЦЭМ G.C.
E. coli TOP10	F–mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZΔM15 ΔlacX74 recA1 araD139 Δ(ara-leu)7697 galU galK λ–rpsL(StrR) endA1 nupG		-		Thermo fisher
Плазмиды Plasmids
Название Title	Маркеры Markers	Структура Structure		Источник Source
pJQ	GmR	Вектор (γ-ori-R6K и mob-сайт oriTRP4), чувствительность к Sm Vector (γ-ori-R6K and mob-site oriTRP4), Sm sensitivity		НИЦЭМ # G.C. #
рTZ	ApR	Вектор (ori pUC19) Vector (ori pUC19)		Pharmacia
рTZА1	ApR	рTZА1::ptxА1		н.р. d.r.
рTZА1М	ApR	рTZА1::ptx*А1		н.р. d.r.
pKS1	GmR	pJQ::ptx*А1		н.р. d.r.
PKS2	GmR KmR	pJQ::ptx*А1::kan		н.р. d.r.
pGemT D	AmR	pUC::dnt		н.р. d.r.
pGemT Dk	AmR KmR	pUC::dnt::cat		н.р. d.r.
PKS7	GmR KmR	pJQ::dnt::cat		н.р. d.r.
PKS9	АmR	pGemT:: ptxР3		н.р. d.r.
PKS10	GmR	pJQ:: ptxР3		н.р. d.r.
pGemTE F2-2	ApR	pGemTE:: fim 2-2		н.р. d.r.
pGemTE F3-2	ApR	pGemTE:: ,fim 3-2		н.р. d.r.
pKКF2	GmR	pJQ:: fim 2-2		н.р. d.r.
pKКF3	GmR	pJQ:: fim 3-2		н.р. d.r.
pKКF2k	GmR KmR	pJQ:: fim 2-2::kan		н.р. d.r.
pKКF3k	GmR KmR	pJQ:: fim 3-2::kan		н.р. d.r.

Н.Р. – сконструированы в настоящей работе; НИЦЭМ – коллекция ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава РФ; # - прототип получен от доктора C. Locht (Институт Пастера в Лилле); ptx* – мутантный оперон ptx; ptxР3, fim 2-1, fim 3-1, fim 2-2, fim 3-2 – последовательности, кодирующие белки соответствующих генотипов

 

D.r. – developed in this research; G.C. – the N.F. Gamaleya Center collection of strains; # – the prototype was received from Dr. C. Locht (Pasteur Institute of Lille); ptx* – the ptx mutant operon; ptxР3, fim 2-1, fim 3-1, fim 2-2, fim 3-2 – sequences encoding proteins for the corresponding genotypes

 

 

Бактерии B. pertussis культивировали на среде КУА (филиал «Медгамал» ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России) с добавлением бараньей крови в концентрации 15% при 35°С в течение 24-36 часов для роста культуры или 72-96 часов для формирования КОЕ. Бактерии E. coli культивировали на агаре L по Miller (Difco) при 37°С. Для пассажа в организме животных использовали мышей линии BALB/С весом 14-16 г.

Клонирование, рестрикционный анализ, лигирование, электрофорез ДНК, генетические манипуляции.

Трансформацию клеток E. coli плазмидной ДНК или лигированной смесью проводили в соответствии со стандартными рекомендациями [22].

Геномную ДНК из бактериальных клеток выделяли методом сорбции на диатомовую землю с использованием набора S-Сорб (ЗАО «СИНТОЛ», Россия). Для выделения плазмидной ДНК использовали набор Plasmid Miniprep Color (ЗАО «Евроген», Россия). Выделение продуктов ПЦР из агарозного геля проводили с использованием набора Cleanup S-Cap (ЗАО «Евроген», Россия). Все образцы выделенной ДНК хранили при температуре ниже –20°С.

ПЦР проводили на приборе «Терцик» (Россия) с использованием специфических праймеров, синтезированных ЗАО «СИНТОЛ».

Подготовка материала для микробиологического анализа и выделения ДНК. Мышей усыпляли эфиром, легкие извлекали и гомогенизировали в 0,85% растворе хлорида натрия рН 7,2-7,4, инкубировали 15 мин при температуре 36°С и центрифугировали при 1500 об/мин в течение 5-10 мин. По 0,1 мл супернатанта высевали на три чашки Петри с селективной средой и использовали для выделения ДНК.

Сайт-направленный мутагенез гена ptxА1 в составе плазмиды рTZА1 проводили по стандартной схеме с использованием PfuTurbo (Альфа-фермент, Россия). Для амплификации целевого фрагмента, содержащего области мутагенеза, использовали праймеры Мf и Мr. Мутагенез проводили методом амплификации исходной плазмиды с целевого фрагмента полимеразой PfuTurbo. В пробирку после проведения ПЦР добавляли 20 единиц рестриктазы DpnI и инкубировали при 37°С 4 часа. Продукт расщепления использовали для трансформации компетентных бактерий E. coli TOP10. Плазмидную ДНК трансформантов анализировали методом секвенирования на наличие вставки искомой последовательности ptx* А1.

Определение нуклеотидной последовательности. Автоматическое секвенирование проводили на 373А Automatic Sequencer (Applied Biosysthems, USA) с использованием реактивов Dye Deoing Terminator AB Isequencing Kit с Taq-полимеразой FS (Perkin Elmer, USA). Для реакции использовали плазмиды или продукты амплификации ДНК.

Фенотипические и молекулярно-биологические характеристики аттенуированных бактерий B. pertussis изучали на отдельных колониях и их репликах, выросших на среде КУА с добавлением 15% дефибринированной крови барана и селективных антибиотиков.

Устойчивость бактерий к антибиотикам проверяли методом реплик на селективные среды КУА, содержащие канамицин (100 мкг/мл), хлорамфеникол (100 мкг/мл), стрептомицин (400 мкг/мл), налидиксовую кислоту (100 мкг/мл) или гентамицин (20 мкг/мл).

Для морфологической характеристики бактерий использовали световую микроскопию. Бактерии окрашивали по Грамму с помощью комплекта реагентов «Микро-ГРАМ-НИЦФ» («НИЦФ», Россия). Микроскопия осуществлялась на бинокулярном микроскопе МИКМЕД-1 (АО «ЛОМО», Россия).

Для агглютинации использовали бактерии из реплик, формирующих отчетливые зоны гемолиза на чашках КУА с кровью и соответствующих фенотипу Str^R Nal^R Cm^R Km^S Gen^S, полученных после рассева бактерий 15-ого пересева на твердой питательной среде и пятого пассажа в организме животных. Для серологического анализа использовали сухие диагностические коклюшные сыворотки к главным агглютиногенам бактерий B. pertussis (1, 2, 3) в соответствии с рекомендациями МУК 4.2.2317-08 «Отбор, проверка и хранение производственных штаммов коклюшных, паракоклюшных и бронхисептикозных бактерий» и производителя NIBSC 89/596, 89/598, 89/600 (Великобритания).

Изучение структуры модифицированных фрагментов генома аттенуированных бактерий B. pertussis проводили с помощью ПЦР ДНК хромосом B. pertussis, содержащих мутантные гены, и анализа последовательности нуклеотидов продуктов амплификации. При проведении ПЦР и секвенировании использованы праймеры, специфичные для последовательностей генов ptx, cat, dnt, fim2, fim3, представленные в таблице 2.

 

Таблица 2. Праймеры, использованные для амплификации и определения нуклеотидной последовательности целевых фрагментов хромосомы B. pertussis

 

Table 2. Amplification and nucleotide sequencing primers for target fragments of B. pertussis chromosome

Мишень Target	Праймеры Primers	Нуклеотидная последовательность Nucleotide sequence
Фрагмент ptxP3ptxА1 Fragment ptxP3ptxА1	S1f	ACCGCCACATCAACGAGGCG
	S1r	CCTATCACCGGCGCTATGCGCAC
	К1KS	GCATTTCCCGGCCGTACCCAC
	К2KS	CCCTCTGCGTTTTGATGGTGC
	KТ277f	GCCATCAACATGATTCCCTAC
	KТ1993r	GTCTTGTTCGCGCAGCGTC
Мутагенез ptxА1 Mutagenesis ptxА1	Мf	GCCGTATACAAGTATGACTCCCG
	Мr	TGTGCCAGATATCCGCTCTG
Фрагмент dnt Fragment dnt	DNTf	CGATATTCCAGTCGTTCGTG
	DNTr	TCGTTCAACACATCCAAGGC
	DNTf ou*	GCTGCTGGGCAATGTGTTCG
	DNTr ou*	CCGCAATGGGCCGAGCTGTT
Фрагмент fim2 Fragment fim2	F2f	ACCCATGCAAATCCCTTTCCAACGC
	F2r	GGGGGGTTGGCGATTTCCAGTTTCTC
	F2fou*	TCAACATGACGGCATTGGCAGT
	F2rou*	TTTCGAGTCGACGTAGGAAGGTCAA
Фрагмент fim3 Fragment fim3	F3f	ATGTCCAAGTTTTCATACCCTGCCT
	F3r	TCAGGGGTAGACGACGGAAAAGCCG
	F3fou*	GACCTGATATTCTGATGCCG
	F3rou*	CGCAAGGCTTGCCGGTTTTTTTTGG

*f_ou и r_ou – прямой и обратный праймеры, расположенные вне зоны аллельного обмена

*f_ou and r_ou - outside primers flanking the allele exchange region

 

РЕЗУЛЬТАТЫ

1. Конструирование рекомбинантных аттенуированных бактерий pertussis нового генотипа ptx⃰А1-ptxР3-fim2-2-fim3-2

Искомый рекомбинант конструировали в результате последовательных аллельных обменов между хромосомой B. pertussis 475 ptxA4-ptxP2-fim2-1-fim3-1-dnt и последовательностями, клонированными в составе рекомбинантной суицидной коньюгативной плазмиды pJQ (Таблица 1) содержащими:

 - мутации, обеспечивающие замену Arg9 на Lys9 и Glu129 на Gly129 в гене ptxА1, мутантный ген получил название ptx⃰ А1 (плазмида pKS1);

- ген dnt, инактивированный в результате инсерции гена устойчивости к хлорамфениколу (dnt :: cat) (плазмида PKS7);

- регуляторную область промотора оперона ptx генотипа ptxP3 (плазмида рKS10);

- гены fim2-2 и fim3-2 (плазмиды pKКF2 и pKКF3).

 

Конструирование рекомбинантных аттенуированных бактерий B. pertussis генотипа ptxP2-ptx⃰ А1:: kan-fim 2-1-fim3-1-dnt.

Рекомбинантная плазмида pKS1, содержащая мутантный ген ptx⃰А1 в составе суицидного вектора pJQ, сконструирована в результате переклонирования гена ptx⃰ А1 из плазмиды рTZА1М. Мутантный ген ptx⃰А1 получен в результате сайт-направленного мутагенеза гена ptxА1 в составе плазмиды рTZА1 по стандартной схеме, описанной в материалах и методах. Плазмида рTZА1 сконструирована в результате переклонирования продукта амплификации хромосомы B. pertussis 284 с праймеров S1f- S1r, содержащей оперон коклюшного токсина генотипа ptxА1 [12]. В результате интеграции последовательности гена kan в сайт StuI, расположенный выше регуляторных и структурных последовательностей оперона ptx, сконструирована плазмида pKS2.

Плазмида pKS2 трансформирована в бактерии E. coli Sm10 и передана в бактерии Rif^RStr^RNal^R B. pertussis 475 в скрещивании с E. coli Sm10/pKS2. Искомые трансконъюганты с фенотипом Str^RGm^SKm^R отбирали на селективной среде КУА с добавлением налидиксовой кислоты и канамицина. Расчищали два раза согласно стандартным методикам на чашках Петри с КУА с добавлением налидиксовой кислоты и канамицина, затем высевали на чашки Петри с КУА с добавлением стрептомицина и канамицина. Выросшие колонии расчищали на чашках Петри со стрептомицином и канамицином и проверяли по маркерам устойчивости к стрептомицину (Str), налидиксовой кислоте (Nal), канамицину (Km) и гентамицину (Gm). Клоны Str^RNal^RKm^R использовали для дальнейшего анализа. Все клоны Str^RNal^RKm^R, выросшие на среде с добавлением стрептомицина, чувствительны к гентамицину. Для определения последовательности ptx⃰А1 методом ПЦР использовали продукт амплификации хромосомы с праймеров KТ277f и KТ1993r, расположенных «ниже» и «выше» праймеров, фланкирующих фрагмент, участвующий в аллельном обмене. Последовательности праймеров приведены в таблице 2. Определение последовательности ptx⃰ А1 трех из рекомбинантов подтвердило наличие триплетов ААG-Lys9 и GGA-Gly129, мутаций, определяющих генотип ptx⃰ А1 (рис. 1а), и последовательности гена kan в сайте StuI (на рисунке не представлена). Таким образом, в результате проведенной работы были сконструированы рекомбинантные аттенуированные бактерии B. pertussis генотипа ptx⃰ А1:: kan-fim 2-1-fim3-1-dnt.

 

Рис. 1а. Фрагмент последовательности гена рtxS1 бактерий B. pertussis генотипа ptx⃰ А1

 

Подчеркнута и выделена курсивом последовательность ATG стартового кодона гена ptx*А1; жирными буквами AAG и GGА выделены замены триплетов CGC и GАА, обусловившие замену Arg9 на Lys9 и Glu129 на Gly129, соответственно, обеспечивающие устранение токсической, ферментативной активности КТ; подчёркнутым жирным шрифтом обозначены замены А на С в положении 204 и G на А в положениях 684, 694 и 696, определяющие генотип ptx*А1

 

 

Fig. 1a. Sequence fragment of the ptxS1 gene of B. pertussis bacteria of the ptx⃰ А1 genotype

 

The ATG sequence of the start codon for the ptx*А1 gene is underlined and italicized; the substitution of CGC and GAA triplets, indicated by bold letters AAG and GGA respectively, results in the replacement of Arg9 with Lys9 and Glu129 with Gly129. This modification effectively eliminates the toxic enzymatic activity of pertussis toxin. Bold letters indicate substitutions: A for C at position 204, and G for A at positions 684, 694, and 696. These substitutions define the ptx*A1 genotype. 

 

Рис. 1б. Фрагмент последовательности регуляторной области промотора оперона ptx бактерий B. pertussis генотипа ptxP3

 

Цифрами обозначены положения нуклеотидов от старта транскрипции (+1); жирным шрифтом обозначена замена G на А в положении -65 и буква С в положении -167 в последовательности, соответствующей генотипу ptxP3; подчёркнутыми буквами обозначены последовательность -10 и старт транскрипции; подчеркнута и выделена курсивом последовательность ATG стартового кодона гена ptx*А1

 

Fig. 1b.  Sequence fragment from the promoter regulatory region of ptx operon of B. pertussis bacteria of the ptxP3 genotype

The numbers indicate the positions of the nucleotides from the start of transcription (+1); replacements of G with A at position -65 and C at position -167 in the sequence corresponding to the ptxP3 genotype are indicated by bold font; transcription initiation is denoted by the underlined sequence, and the start codon of the ptx*A1 gene is indicated by the underlined and italicized sequence ATG

 

Констурирование рекомбинантных аттенуированных бактерий B. pertussis генотипа ptx⃰ А1:: kan-fim 2-1-fim3-1, содержащих нокаутную мутацию в гене dnt.

Для получения рекомбинантов B. pertussis, содержащих мутантный ген ptx⃰А1 и нокаутную мутацию в гене dnt, было проведено скрещивание бактерий E. coli Sm10/pKS7 с бактериями Str^RNal^RKm^R B. pertussis ptx⃰ А1::kan-fim 2-1-fim3-1, где плазмида pKS7 (Таблица 1), сконструированная на основе суицидной плазмиды pJQ, содержит продукт амплификации хромосомы B. pertussis 475 с праймеров DNTf, DNTr (Таблица 2) и последовательность гена cat, интегрированную в TthI сайт ампликона. Трансконъюганты в скрещивании отбирали на селективной среде, содержащей налидиксовую кислоту и хлорамфеникол. Расчищали на той же среде и высевали на чашки Петри с добавлением стрептомицина и хлорамфеникола. Выросшие колонии двукратно расчищали на чашках со стрептомицином и хлорамфениколом и проверяли по маркерам устойчивости к Str, Nal, Gm, Km и Сm. Все клоны, выросшие на среде с добавлением стрептомицина, чувствительны к гентамицину. Клоны Str^RNal^RСm^RKm^RGm^S использовали для дальнейшего анализа. Наличие и расположение последовательностей гена cat в гене dnt определяли методом ПЦР с праймерами DNTf_ou и DNTr_ou (Таблица 1) и секвенированием продукта амплификации ДНК рекомбинантов с праймеров DNTf, DNTr. Во всех случаях в ПЦР зарегистрированы фрагменты ожидаемых размеров. Фрагмент последовательности продукта амплификации хромосомы рекомбинанта с праймеров DNTf, DNTr, представленный на рис. 2, подтверждает нарушение структуры гена dnt в результате инсерции последовательности гена cat.

 

Рис. 2. Фрагмент последовательность гена dnt, содержащего инсерцию гена cat (dnt::cat)

 

Прописными буквами обозначена последовательность гена dnt, строчными буквами – фрагмент последовательности гена cat, интегрированной в ген dnt

 

Fig. 2. dnt gene fragment, modified by insertion of the cat gene (dnt::cat)

Capital letters denote the dnt gene sequence, while lowercase letters represent a fragment of the cat gene sequence that has been integrated into the dnt gene

 

Таким образом, были получены рекомбинантные аттенуированные бактерии B. pertussis генотипа ptx⃰А1::kan-fim 2-1-fim 3-1-dnt::cat, содержащие мутации R9K, E129G в опероне ptx, инсерцию последовательности kan в гене ptx⃰А1 и нокаутную мутацию в гене dnt.

 

Конструирование рекомбинантных аттенуированных бактерий B. pertussis генотипа ptxP3 мутантного оперона ptx.

При конструировании аттенуированных бактерий B. pertussis «нового» генотипа ptxP3 использованы те же методические приемы. Для аллельного обмена была сконструирована плазмида pКS10, содержащая фрагмент последовательности регуляторной области оперона ptx B. pertussis «нового» генотипа ptxP3. Последовательность «нового» генотипа ptxP3 получена в результате амплификации ДНК хромосомы штамма B. pertussis 55-12, выделенного на территории РФ и любезно предоставленного проф. О.Ю. Борисовой. Для амплификации целевого фрагмента, содержащего мутацию и сайт узнавания StuI, использованы праймеры K1KS-K2KS (Таблица 2). Амплифицированный фрагмент клонирован в векторе pGemT (плазмида pКS9) и переклонирован в вектор pJQ. Рекомбинантная плазмида получила название pКS10.

Плазмиду pКS10 трансформировали в бактерии E. coli SМ10, полученные трансформанты, использованные в скрещивании с аттенуированными бактериями Str^RNal^RСm^RKm^R B. pertussis ptx⃰А1::kan, dnt::cat. Трансконъюганты отбирали на селективной среде, содержащей налидиксовую кислоту и гентамицин. Так как клонированный в составе плазмиды целевой фрагмент содержит область, включающую сайт StuI, в который в хромосоме реципиента интегрирована последовательность гена kan, то событие рекомбинации, приводящее к искомой замене последовательности регуляторной области на ptxP3, должно сопровождаться потерей маркера устойчивости к канамицину. Nal^RGm^R  трансконъюганты B. pertussis высевали до отдельных колоний на среду КУА с добавлением Nal и Str и выросшие колонии методом реплик переносили на селективные среды, содержащие один из пяти антибиотиков Cm, Str, Gm, Km или Nal. Трансконъюганты с фенотипом Km^SCm^RNal^RStr^RGm^S проверяли на наличие последовательности гена kan, соответствие структуры гена ptx⃰А1 и его регуляторной области генотипу ptxP3. Анализ соответствующих структур проводили с помощью ПЦР и секвенирования как описано выше.

Все протестированные Str^RNal^RСm^RKm^S B. pertussis рекомбинанты содержали искомые триплеты ААG-Lys9 и GGA-Gly129, замены G (-65) на А (-65) цитозин С в положении (-167), определяющие генотип ptxP3 в регуляторной области, не содержали последовательности гена kan (рис. 1а и 1б). Последовательность гена dnt, как и в бактериях реципиента, содержит инсерцию гена cat (рис. 2).

Таким образом, в результате проведенной работы были получены рекомбинантные аттенуированные бактерии B. pertussis генотипа ptxP3-ptx⃰ А1-fim 2-1-fim 3-1, содержащие нокаутную мутацию в гене dnt.

 

Конструирование рекомбинантных аттенуированных бактерий B. pertussis «новых» генотипов fim2-2 и fim3-2. Характеристики рекомбинантных плазмид, pKКF2 и pKКF3, pKКF2k, pKКF3k, для аллельного обмена и содержащих мутантные последовательности и их маркированные канамицином (kan) копии, представлены в таблице 1.

Плазмиды pKКF2 и pKКF3 сконструированы в результате переклонирования продуктов амплификации хромосомы B. pertussis 284 генотипов fim2-2 и fim3-2 [12] с праймерами F2f – F2r и F3f – F3r, соответственно, предварительно клонированными в вектор pGemTE (плазмиды pGemTE F2-2 и pGemTE F3-2). Для конструирования плазмид pKКF2k и pKКF3k последовательность гена kan интегрирована в целевые последовательности плазмид pKКF2 и pKКF3 по сайтам StuI, и EheI, соответственно. Структура всех рекомбинантных плазмид подтверждена определением последовательности клонированных фрагментов.

Рекомбинантные бактерии B. pertussis ptxP3-ptx⃰А1-fim2-2-fim3-2-dnt::cat конструировали в два последовательных этапа. На первом этапе из рекомбинантов B. pertussis ptxP3-ptx⃰А1-fim2-1-fim3-1-dnt::cat получены бактерии B. pertussis генотипа ptxP3-ptx⃰ А1-fim2-2-fim3-1-dnt::cat. На втором этапе – бактерии B. pertussis генотипа ptxP3-ptx⃰ А1-fim2-2-fim3-2-dnt::cat. Каждый из рекомбинантов получали в две стадии. На первой, согласно описанной схеме, последовательно отбирали рекомбинанты, содержащие гены fim2-2::kan и fim3-2::kan, меченые канамицином. На втором – рекомбинанты, потерявшие ген kan в составе fim2-2 и fim3-2. Доказательство соответствия структуры хромосомы рекомбинанта проводили по результатам анализа последовательности нуклеотидов продуктов ПЦР с праймеров F2f_ou-F2r_ou и F3f_ou-F3r_ou (Таблица 2).

Последовательности соответствующих ампликонов, подтверждающие «новый» генотип ptxP3-ptx⃰ А1-fim2-2-fim3-2 и инактивацию гена dnt::cat в хромосоме искомого рекомбинанта B. pertussis 4МКК ptxP3-ptx⃰ А1-fim 2-2-fim 3-2-dnt::cat приведены на рис. 1а и 1б, 2, 3, 4.

 

Рис. 3. Последовательность гена fim2 бактерий B. pertussis генотипа fim2-2

 

Подчеркнут и выделен курсивом стартовый кодон ATG; подчеркнут и выделен жирным шрифтом гуанидин 521А, заменивший 521G в нумерации, исчисляемой от первого нуклеотида стартового кодона. Замена нуклеотида сопровождается заменой 174 Arg на Lys

 

Fig. 3. The fim2 gene sequence of B. pertussis bacteria of the fim2-2 genotype

The ATG sequence of the start codon is underlined and italicized; underlined and highlighted in bold is guanidine 521A, which replaced 521G in the numbering calculated from the first nucleotide of the start codon. The nucleotide replacement is accompanied by the replacement of 174 Arg for Lys

 

 

Рис. 4. Последовательность гена fim3 бактерий B. pertussis генотипа fim3-2

 

Подчеркнут и выделен курсивом стартовый кодон ATG; подчеркнут и выделен жирным шрифтом гуанидин 248А, заменивший 248G в нумерации, исчисляемой от первого нуклеотида стартового кодона. Замена нуклеотида сопровождается заменой 87 Ala на Glu

 

Fig. 4. The fim3 gene sequence of B. pertussis bacteria of the fim3-2 genotype

The ATG sequence of the start codon is underlined and italicized; guanidine 248A is underlined and highlighted in bold, replacing 248G in the numbering calculated from the first nucleotide of the start codon. The nucleotide substitution is accompanied by the substitution of 87 Ala for Glu

 

 

2. Изучение стабильности рекомбинантных аттенуированных бактерий B. pertussis 4МKК в процессе хранения, пересева на питательной среде и при культивировании бактерий в организме лабораторных животных

Для анализа использовали рекомбинантные бактерии B. pertussis спустя 1 и 12 месяцев после лиофильного высушивания и хранения. После лиофильного высушивания бактерии восстанавливали в соответствии с требованиями МУК 4.2.2317-08.

Для пересева культур на питательной среде и пассажа в организме мышей использовали бактерии B. pertussis из ампул, хранившихся в течение месяца. 15 пересевов культуры проводили на среде КУА с добавлением дефибринированной крови барана. Для каждого пересева использовали суточную культуру, выросшую в штрихе после предыдущего пересева. Культуру после 15 пассажа высевали до отдельных КОЕ и анализировали по описанной ниже схеме.

Для пассажей в организме мышей трем особям интраназально вводили по 30 мкл бактериальной суспензии мутностью 10 МОЕ. Через 3-7 дней проводили вскрытие, выделяли и гомогенизировали легкие, гомогенат центрифугировали в 0,5 мл 0,9% раствора хлористого натрия и центрифугировали в течении 5 минут при 1500 оборотов для удаления остатков ткани. По 100 мкл супернатанта высевали на 3 чашки Петри со средой КУА с добавлением крови и стрептомицина и инкубировали при 36°С в течение 5-7 суток. Оставшийся супернатант использовали для выделения ДНК. Выросшие бактериальные колонии анализировали по морфологии, наличию зон гемолиза, бактерии из некоторых КОЕ анализировали с помощью светового микроскопа после окрашивания по Граму. Перед каждым следующим пассажем отбирали типичные для коклюша КОЕ, выросшие на среде КУА со стрептомицином, суспендировали в пробирке Eppendorf, суспензию доводили до объема 100-200 мкл 0,9% раствором хлорида натрия и повторно интраназально вводили мышам по 30 мкл. Процедуру повторяли 5 раз. КОЕ В. pertussis 4МКК, выросшие после последнего пассажа, проверяли на стабильность морфологических и фенотипических характеристик микробных клеток и колоний, анализировали гемолитическую активность, состав видоспецифических агглютиногенов, маркеры устойчивости к антибиотикам, структуру модифицированных участков хромосомы методом ПЦР и определения нуклеотидной последовательности продуктов ПЦР.

КОЕ, выросшие после пассажей в организме мышей и пересевов на среде КУА с кровью, формировали типичные для B. pertussis округлые блестящие колонии, размером около 1,5 мм, с четко очерченными краями, гладкой поверхностью и зоной гемолиза диаметром 1-2 мм (проверено по 500 КОЕ после пересевов и пассажей на животных).

Пересев бактериальных колоний B. pertussis 4МКК на селективные среды методом реплик не выявил колоний, утративших устойчивость к хлорамфениколу, стрептомицину или налидиксовой кислоте. Суспензии бактерий из 25 реплик после пассажей (№ 1-25) на среде КУА и 21 (№ 26-46) – после пассажей в организме мышей показали достоверную агглютинацию с тремя специфическими сыворотками. При микроскопии грамотрицательные коккобациллы располагались отдельно или образовывали цепочки разного размера. Результаты анализа представлены в таблице 3.

 

Таблица 3. Фенотипический анализ бактерий B. pertussis 4МКК после культивирования на среде КУА и пяти пассажей в легких мышей

 

Table 3. Phenotypic analysis of B. pertussis 4MKK bacteria, conducted after cultivation on casein-charcoal agar (CCA) and five serial passages in mouse lungs

 

№	Фенотип: рост на среде КУА и КУА с добавлением антибиотика/Hly+/Агглютиногены 1.2.3 Phenotype: growth on CCA and CCA with added antibiotic/Hly+/ Agglutinogens 1.2.3
	Str Str	Nal Nal	Cm Cm	Km Km	КУА CCA	Hly+ Hly+	Агг 1 Agg 1	Агг 2 Agg 2	Агг 3 Agg 3
1	+	+	+	-	+	+	++	++	+++
2	+	+	+	-	+	+	+	++	+++
3	+	+	+	-	+	+	+	++	++
4	+	+	+	-	+	+	+	++	+++
5	+	+	+	-	+	+	++	++	+++
6	+	+	+	-	+	+	++	++	+++
7	+	+	+	-	+	+	++	+++	+++
8	+	+	+	-	+	+	+++	++	+++
9	+	+	+	-	+	+	++	+	+++
10	+	+	+	-	+	+	+	++	+++
11	+	+	+	-	+	+	++	++	+++
12	+	+	+	-	+	+	++	++	+++
13	+	+	+	-	+	+	++	+++	+++
14	+	+	+	-	+	+	++	++	+++
15	+	+	+	-	-	+	++	++	+++
16	+	+	+	-	+	+	++	++	+++
17	+	+	+	-	+	+	++	++	+++
18	+	+	+	-	+	+	+++	++	+++
19	+	+	+	-	+	+	+++	+++	+++
20	+	+	+	-	+	+	++	++	+++
21	+	+	+	-	+	+	++	++	+++
22	+	+	+	-	+	+	++	++	++
23	+	+	+	-	+	+	++	++	++
24	+	+	+	-	+	+	++	++	+++
25	+	+	+	-	+	+	++	++	+++
26	+	+	+	-	+	+	++	++	+++
27	+	+	+	-	+	+	+	++	+++
28	+	+	+	-	+	+	++	++	+++
29	+	+	+	-	+	+	+	++	++
30	+	+	+	-	+	+	++	++	+++
31	+	+	+	-	+	+	++	++	+++
32	+	+	+	-	+	+	+	++	++
33	+	+	+	-	+	+	++	++	+++
34	+	+	+	-	+	+	+++	+++	+++
35	+	+	+	-	+	+	++	+++	+++
36	+	+	+	-	+	+	++	++	+++
37	+	+	+	-	+	+	++	++	+++
38	+	+	+	-	+	+	++	++	+++
39	+	+	+	-	+	+	++	++	+++
40	+	+	+	-	+	+	++	++	++
41	+	+	+	-	+	+	++	++	++
42	+	+	+	-	+	+	++	++	++
43	+	+	+	-	+	+	++	++	+++
44	+	+	+	-	+	+	++	++	+++
45	+	+	+	-	+	+	++	++	+++
46	+	+	+	-	+	+	++	++	+++
47	-	-	-	-	+	+	++	+++	+++
48	-	-	-	-	+	+	++	++	+++
49	+	+	+	-	+	+	++	++	++
50	+	+	+	-	+	+	++	++	+++

№ – номер ячейки в матрице; маркер устойчивости к антибиотикам: Str – стрептомицину, Nal – налидиксовой кислоте, Cm – хлорамфениколу, Km – канамицину; Hly+ –гемолитическая активность; Агг 1, 2, 3 – результаты агглютинации на стекле; № 1-25 – КОЕ после пассажей на среде КУА; № 26-46 – КОЕ после пассажей в организме мышей; № 47-48 – бактерии B. pertussis 475 (Km^SCm^SNal^SStr^S); № 49-50 – бактерии B. pertussis 4MKК (Km^SCm^RNal^RStr^R)

                  

№ – cell number in the matrix; a marker of antibiotic resistance: Str – streptomycin, Nal – nalidixic acid, Cm – chloramphenicol, Km – kanamycin; Hly+ – hemolytic activity; Agg 1, 2, 3 – slide agglutination results; No. 1-25 – CFU after passages on the CCA medium; No. 26-46 – CFU after passages in the mice organism; No. 47-48 – B. pertussis 475 (Km^SCm^SNal^SStr^S); No. 49-50 – B. pertussis 4MKК (Km^SCm^RNal^RStr^R)  

 

ОБСУЖДЕНИЕ

Несмотря на высокий уровень охвата детей вакцинацией, достигающий 95% во многих странах, наблюдается рост заболеваемости коклюшем. Многие эксперты полагают, что причиной этого феномена является широкое применение БКВ в составе комбинированных препаратов АаКДС. Предполагается, что применение БКВ не обеспечивает достаточной продолжительности иммунитета, способствует формированию и распространению вирулентных бактерий возбудителя коклюша «новых» генотипов, способных преодолевать иммунный ответ на антигены «старых» генотипов, входящих в состав вакцин, что снижает защиту детей и взрослых от заражения возбудителем коклюша и дальнейшего распространения заболевания. Рассматривается необходимость замены вакцинных штаммов на «новые», несущие современные генотипы, в том числе и в Российской Федерации [12, 13]. Однако прямых экспериментальных подтверждений этой гипотезы не получено.

Настоящая работа посвящена конструированию изогенных аттенуированных бактерий B. pertussis, содержащих разные генотипы вирулентных бактерий B. pertussis 475. Проведён анализ стабильности структуры и фенотипических характеристик аттенуированных бактерий B. pertussis 4МKК генотипа ptxP3-ptx⃰А1-fim2-2-fim3-2.

Конструирование изогенных аттенуированных бактерий B. pertussis «нового» генотипа включало два этапа аллельного обмена между мутантными генами в составе плазмиды и нативными в составе хромосомы. Плазмиды и штаммы, использованные в работе представлены в таблице 2. Нуклеотидные последовательности генов ptx, fim2, fim3 сконструированного рекомбинанта B. pertussis 4МКК совпадают с описанными в литературе в качестве «новых» генотипов ptxА1, fim2-2, fim3-2 [23]. Сопоставление последовательностей гена ptx бактерий исходного штамма с генами B. pertussis 4МKК подтвердило замены Lys9 (AAG) на Arg9 (CGC), Gly129 (GGA) на Glu129 (AAG) в опероне ptx, приведших к утрате ферментативной активности КТ, и замену нуклеотида с на t в положении –65, соответствующую «новому» генотипу ptxP3. Продукты ПЦР, подвергшиеся анализу последовательностей, полностью включают в себя фрагменты, участвующие в аллельном обмене. Полное соответствие их последовательности и последовательностей на границе областей аллельного обмена до рекомбинации доказывает сохранение структуры целевых генов после рекомбинации. Таким образом, сконструированные нами рекомбинантные бактерии B. pertussis 4МКК содержат аллели ptxP3, ptx*А1, fim 2-2, fim 3-2 и не содержат неконтролируемых изменений на границах фрагментов, участвующих в рекомбинации. Аналогичные результаты получены при анализе сконструированных нами ранее аттенуированных бактерий B. pertussis 4МKS [14], входящих в состав живой рекомбинантной вакцины интраназального применения ГамЖВК, прошедшей 3 фазы клинических исследований с участием взрослых добровольцев. Важно отметить, что аттенуированные бактерии B. pertussis 4МKS, использованные на всех этапах доклинических и клинических исследований, имели генотип ptxP3-ptx*А4-fim2-2-fim3-1, несмотря на отсутствие упоминания о генотипах фимбрий и описания этапа конструирования генотипа fim2-2 в ранее опубликованной работе [14]. Описание полного генотипа бактерий B. pertussis 4МKS, недостающего этапа конструирования и результаты полноразмерного секвенирования генома B. pertussis 4МKS, подтвердившие наличие описанных замен в гене ptx*А4, регуляторной области ptxP3, наличие вставки в гене dnt::cat и мутации в гене fim 2, определяющей его фенотип fim 2-2, приведены в заявке на изобретение «Иммунобиологическое средство для профилактики коклюша и его применение» №202593073 от 19.11.2025. Представленные результаты позволяют утверждать, что сконструированные ранее аттенуированные бактерии B. pertussis 4МKS изогенны бактериям B. pertussis 4МКК и отличаются друг от друга генотипами ptx*А4 и ptx*А1, fim 3-1 и fim 3-2.

Стабильность структуры модифицированных фрагментов ptxА1, fim 2-2, fim 3-2 определяли так же, как и в предыдущих исследованиях [14] в соответствии с приведённой выше схемой. Бактерии после последнего пассажа на питательной среде или в организме мышей высевали на среду КУА с кровью, оценивали морфологию колоний и наличие зон гемолиза. По 3-5 колоний пересевали на твердой питательной среде, выделяли хромосомную ДНК, проводили амплификацию с указанными выше праймерами, продукт амплификации очищали (материалы и методы) и проводили определение последовательности нуклеотидов. Ни в одном из проанализированных последовательностей не было выявлено отклонений от ожидаемой структуры. Таким образом, структура измененных участков ДНК рекомбинантных бактерий B. pertussis 4МКК, так же, как и ранее сконструированных рекомбинантов, оставалась стабильной в процессе пересевов бактерий на питательной среде и при пассажах в организме мышей. Следует отметить, что аналогичные исследования, выполненные с использованием оригинального ПЦР анализа популяций бактерий BPZE1, также подтвердили стабильность генетической структуры рекомбинантов [24].

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Изогенность бактерий B. pertussis 4МKS и B. pertussis 4МКК, безопасность и высокая защитная активность препарата ГамЖВК на основе бактерий B. pertussis 4МKS позволяют рассчитывать на наличие аналогичных характеристик у аттенуированных бактерий рекомбинанта B. pertussis 4МКК, содержащих «новые» генотипы  ptxА1, fim2, fim3 и ptxР3. Экспериментальное подтверждение этого предположения в процессе доклинических и клинических исследований аттенуированных бактерий B. pertussis 4МКК позволит рассматривать их в качестве второго компонента живой коклюшной вакцины для защиты детей и взрослых от циркулирующих бактерий «нового» и «старого» генотипов в рамках изложенной выше гипотезы. В следующей публикации планируется представить результаты сравнительного исследования иммуногенности и защитной активности изогенных бактерий B. pertussis 4МKS и B. pertussis 4МКК. Предполагаемые отличия аффинности специфических антител к белкам Fim2, Fim3 и КТ «старого» генотипа к антигенам «нового» и «старого» генотипов послужат аргументом в пользу гипотезы, предполагающей необходимость разработки вакцин на основе антигенов «новых» генотипов в условиях массовой вакцинации, прежде всего с применением БКВ в составе препаратов АаКДС, и описанной выше изменчивости бактерий B. pertussis.

 

Благодарности

Авторы выражают глубокую признательность заведующей лаборатории анализа геномов ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России Ольге Львовне Ворониной и ее сотрудникам за помощь в проведении секвенирования геномов рекомбинантных штаммов B. pertussis.

About the authors

Sergey V. Kulikov

N.F. Gamaleya National Research Center for Epidemiology and Microbiology

Email: stromdang@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-7478-3624

junior researcher, Laboratory of bacterial genetics, Department of medical microbiology

Russian Federation, Moscow

Matvej A. Loktev

N.F. Gamaleya National Research Center for Epidemiology and Microbiology

Email: m_loktev00@mail.ru
ORCID iD: 0009-0002-5128-7681

research assistant, Laboratory of bacterial genetics, Department of medical microbiology

Russian Federation, Moscow

Alisa Yu. Medkova

N.F. Gamaleya National Research Center for Epidemiology and Microbiology

Author for correspondence.
Email: baburida@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-1509-0622

Cand. Sci. (Med.), senior researcher, Laboratory of bacterial genetics, Department of medical microbiology

Russian Federation, Moscow

Galina K. Sadykova

Gamaleya National Research Center for Epidemiology and Microbiology

Email: gksadykova@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-2729-6767

Cand. Sci. (Biol.), senior researcher, Laboratory of molecular genetics

Russian Federation, Moscow

Lyudmila N. Sinyashina

N.F. Gamaleya National Research Center for Epidemiology and Microbiology

Email: vasilissa7777@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-1708-5453

Dr. Sci. (Med.), leading researcher, Laboratory of bacterial genetics, Department of medical microbiology

Russian Federation, Moscow

Alexei G. Prilipov

National Research Center for Epidemiology and Microbiology named after the Honorary Academician N.F. Gamaleya

Email: a_prilipov@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-8755-1419

D. Sci. (Biol.), leading researcher, Head, Laboratory of molecular genetics

Russian Federation, Moscow

Gennadiy I. Karataev

Federal Research Centre for Epidemiology and Microbiology named after the honorary academician N.F. Gamaleya

Email: karataevgi@rambler.ru
ORCID iD: 0000-0001-8771-6092

D. Sci. (Biol.), Head, Laboratory of genetics of bacteria

Russian Federation

References

Supplementary files