Comparison of the genetic profiles of  Burkholderia cenocepacia  in patients with cystic fibrosis before and during targeted therapy

Ekaterina D. Dzhovmardova; Джовмардова Екатерина Дмитриевна; Ekaterina A. Strazhina; Стражина Екатерина Александровна; Olga V. Kondratenko; Кондратенко Ольга Владимировна; Igor V. Zalevskiy; Залевский Игорь Витальевич; Daniil A. Kokorev; Кокорев Даниил Андреевич; Artem E. Ponomarev; Пономарев Артем Евгеньевич; Evgenii V. Zarov; Заров Евгений Владимирович

doi:10.36233/0372-9311-852

Comparison of the genetic profiles of Burkholderia cenocepacia in patients with cystic fibrosis before and during targeted therapy

Authors: Dzhovmardova E.D.¹, Strazhina E.A.¹, Kondratenko O.V.¹, Zalevskiy I.V.¹, Kokorev D.A.¹, Ponomarev A.E.¹, Zarov E.V.¹
Affiliations:
1. Samara State Medical University
Issue: Vol 103, No 4 (2026)
Pages: 516-529
Section: ORIGINAL RESEARCHES
URL: https://microbiol.crie.ru/jour/article/view/19109
DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-852
EDN: https://elibrary.ru/TMSCWU
ID: 19109

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

Introduction. Cystic fibrosis is an autosomal recessive genetic disorder caused by mutations in the CFTR gene and characterized by involvement of the exocrine glands. Of particular clinical importance for patients with cystic fibrosis are bacteria Burkholderia cenocepacia, due to their propensity for persistence and the development of chronic lower respiratory tract infection, which remains the leading cause of death in this patient population.

The aim of the study was to analyze the presence of genetic determinants associated with the production of pathogenicity factors in B. cenocepacia isolates from respiratory samples of patients with cystic fibrosis before the start of targeted therapy and for 36 months after its start, regardless of the specific type of targeted therapy.

Materials and methods. 151 B. cenocepacia isolates from respiratory samples of 12 patients with cystic fibrosis in the Samara Region were studied, while 32 isolates (21.2%) were isolated from patients before the start of targeted therapy, and 119 (78.8%) after its start for 36 months. The genetic profiles of the strains were analyzed for the presence of 13 genes associated with the production of a number of B. cenocepacia pathogenicity factors of different groups: fliC, fliJ, rpoN, shvR, luxR, atsR, rpfF, katA, katB, hppD, mgtC, zmpA, zmpB. At the second stage of the study, the occurrence of combinations of genes grouped by their functions was assessed: genes associated with bacterial motility and adhesion (fliC, fliJ, rpoN, shvR); genes associated with quorum sensing systems and biofilm formation (shvR, luxR, atsR, rpfF); genes encoding virulence factors associated with evasion of the immune response, tissue damage and existence in conditions of micronutrient deficiency (katA, katB, hppD, mgtC, zmpA, zmpB).

Results. During targeted therapy, a statistically significant increase in the prevalence of katA genes (associated with protection against peroxide under iron-deficient conditions) and the ability to grow in the presence of carbon sources was observed (p < 0.05). The mgtC-fliC gene combination, associated with survival inside macrophages and loss of motility, was found in 25.0% of isolates before targeted therapy and increased to 45.4% of isolates during targeted therapy, with statistically significant differences.

Conclusion. Against the background of targeted therapy, there is a tendency to increase the frequency of strains with genes associated with the possibility of survival inside phagocytes and resistance to oxidative stress (katA, katB, mgtC, rpfF, zmpA, zmpB). In isolates obtained against the background of targeted therapy, there was no significant change in the occurrence of regulatory genes for quorum sensing systems and biofilm formation.

Keywords

cystic fibrosis, Burkholderia cenocepacia, pathogenicity factors, genetic determinants, targeted therapy

Full Text

Введение

Муковисцидоз (МВ) — аутосомно-рецессивное моногенное наследственное заболевание, возникающее в результате мутаций в гене белка трансмембранного регулятора проводимости МВ (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator, CFTR) [1]. Следствием мутации гена является нарушение синтеза, структуры и функции CFTR, который представляет собой хлоридный трансмембранный канал, локализованный в апикальной части мембран эпителиальных клеток, выстилающих выводные протоки желёз внешней секреции [2]. Наряду с нарушением транспорта ионов хлора через клеточную мембрану, усиливаются реабсорбция ионов натрия и пассивное поступление воды в эпителиальные клетки, что вызывает изменение электролитного состава и дегидратацию апикальной поверхности секреторного эпителия [3]. Патологический процесс при МВ носит мультисистемный характер, поскольку сопровождается образованием густого вязкого секрета, нарушающего функционирование жизненно важных органов и систем: дыхательного и желудочно-кишечного трактов, поджелудочной железы, печени, слюнных и потовых желёз, репродуктивной системы¹.

Следует отметить, что основной причиной осложнений и летальных исходов при МВ является поражение дыхательных путей. Обструкция и выраженное воспаление, обусловленные накоплением вязкого секрета, инициируют повреждение бронхолёгочной системы, приводящее к ухудшению лёгочной функции и прогрессированию дыхательной недостаточности. Перечисленные изменения создают благоприятные условия для первичной колонизации и последующей хронической персистенции патогенных микроорганизмов в дыхательных путях пациентов с МВ [4–6]. Спектр патогенов, вызывающих инфекции респираторного тракта у пациентов с МВ, неуклонно растёт. В секрете нижних дыхательных путей пациентов с МВ чаще всего обнаруживают Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, бактерии комплекса Burkholderia cepacia, Stenotrophomonas maltophilia и Achromobacter spp. [7–10]. Особое клиническое значение имеет B. cenocepacia, входящая в B. cepacia complex — группу, насчитывающую более 20 родственных видов бактерий, которые могут вызывать опасные для жизни заболевания у иммунокомпрометированных людей, в том числе у больных МВ [11]. Опасность данного микроорганизма обусловлена обширным набором факторов патогенности, которые обеспечивают не только возможность персистенции патогена в респираторном тракте пациентов с МВ, но и повреждение лёгочной ткани, проявляющееся прогрессирующим снижением показателей функции внешнего дыхания [12]. Дополнительные трудности в лечении инфекции, вызванной бактериями комплекса B. cepacia, связаны с природной резистентностью к широкому спектру антибактериальных препаратов и быстрым формированием приобретённой устойчивости [13–16]. Патогенетический потенциал данных бактерий ассоциирован с широким перечнем генов. Так, ген сигма-фактора 54 rpoN ассоциирован с бактериальной подвижностью, регуляцией образования биоплёнок за счёт контроля синтеза экзополисахаридов, стабилизирующих структуру биоплёнки, а также потенциированием способности к выживанию бактерий внутри макрофагов, задерживая слияние фаголизосом. Ген rpfF участвует в регуляции систем quorum sensing (QS), влияя на синтез сигнальных молекул N-ацил-гомосеринлактонов, уровень которых зависит от плотности бактериальной популяции, и регулируя экспрессию факторов вирулентности. Наличие гена shvR связано с характером морфологии колоний, биоплёнкообразованием, а также экспрессией генов, ответственных за синтез протеаз, липаз и компонентов системы секреции типа II, обеспечивая переход от внутриклеточного персистирования к острой воспалительной реакции. Ген mgtC кодирует белок вирулентности, обеспечивающий выживание в условиях дефицита магния и внутриклеточную персистенцию в макрофагах. Гены katA и katB кодируют каталазы/пероксидазы, которые играют защитную роль в окислительных реакциях, обеспечивая устойчивость к H₂O₂ и активным формам кислорода. Ген atsR, гибридный регулятор сенсорных киназ, представляет собой отрицательный регулятор вирулентности, поскольку его отсутствие приводит к усиленной продукции факторов вирулентности. Гены zmpA и zmpB кодируют синтез металлопротеаз, принадлежащих к цинковым ферментам, обладающим протеолитической активностью, способным разрушать ткани хозяина и модулировать иммунный ответ, включая деградацию трансферрина и иммуноглобулинов. Ген hppD кодирует фермент, необходимый для биосинтеза пигментов, которые обеспечивают защиту бактерий от активных форм кислорода, что подтверждается повышенной чувствительностью непигментированных штаммов к окислительному стрессу. В свою очередь, гены fliC и fliJ ответственны за морфогенез флагелл и бактериальную подвижность, содействующие адгезии и инвазии эпителиальных клеток, а также активации иммунного ответа. Ген luxR является регулятором экспрессии генов вирулентности, участвует в адаптации к условиям организма хозяина и межбактериальном взаимодействии.

Терапия пациентов с МВ является комплексной и пожизненной. Существенным этапом в её развитии стало внедрение таргетной терапии, направленной на восстановление структуры и функции дефектного белка CFTR [17, 18]. Ключевую роль в этом направлении играют CFTR-модуляторы, классифицируемые на потенциаторы, улучшающие функцию ионного канала на поверхности клетки, и корректоры, способствующие правильному сворачиванию и транспорту дефектного белка CFTR к апикальной мембране эпителиальных клеток [19–21].

Целью исследования стал анализ наличия генетических детерминант, ассоциированных с продукцией факторов патогенности, у изолятов B. cenocepacia, выделенных из респираторных образцов пациентов с МВ до начала таргетной терапии и в течение 36 мес после её начала независимо от конкретного вида таргетной терапии.

Материалы и методы

Биоэтические требования

Использованные в данном исследовании материалы не содержат персональных данных пациентов. В соответствии с требованиями Биоэтического комитета РФ каждый пациент или его законный представитель подписывал информированное согласие на проведение лабораторных исследований. Работа с образцами респираторных проб пациентов была одобрена Комитетом по биоэтике при Самарском государственном медицинском университете (протокол № 252 от 07.09.2022).

Штаммы, условия культивирования и хранения

Штаммы B. cenocepacia (n = 151) выделены из респираторных образцов 12 пациентов Самарской области с МВ как до начала применения препаратов таргетной терапии, так и на фоне её получения. При этом 32 (21,2%) изолята выделены от пациентов с МВ до начала применения таргетной терапии, а 119 (78,8%) — после её начала. Большинство пациентов получали терапию ивакафтором/тезакафтором/элексакафтором + ивакафтором (9 человек), 2 пациентов — ивакафтором/лумакафтором, и у одного пациента была проведена замена двойной терапии на тройную в процессе лечения. Ввиду малой выборки образцов от пациентов последних групп оценка влияния вида терапии на динамику генетических профилей не проводилась. Штаммы были выделены в рамках рутинного микробиологического исследования. Первичный посев биоматериала осуществляли на расширенный перечень питательных сред, включающий: 5% кровяной агар с дефибринированной кровью («BioRad»), универсальную хромогенную среду («Conda»), OFPBL-агар («HiMedia»), среду Сабуро («HiMedia»), шоколадный агар («HiMedia»). Посевы инкубировали в термостате при 37°С в течение 24 ч, далее при комнатной температуре до 7 сут, а засеянные чашки с селективной средой для B. cepacia (OFPBL-агар) до 28 сут включительно с ежедневным просмотром. Идентификацию выросших колоний проводили на масс-спектрометре «Microflex» («Bruker») методом прямого нанесения.

Детекция генов, кодирующих факторы патогенности

Сравнение генетических профилей проводилось методом мультиплексной полимеразной цепной реакции (ПЦР) на дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК), выделенную из 151 изолята B. cenocepacia. На первом этапе исследования, независимо от вида таргетной терапии, был проведён анализ генетических профилей штаммов на наличие 13 генов, ассоциированных с продукцией ряда факторов патогенности B. cenocepacia: fliC, fliJ, rpoN, shvR, luxR, atsR, rpfF, katA, katB, hppD, mgtC, zmpA, zmpB. Выбор генов определялся их доказанной значимостью в процессах колонизации, персистенции, тканевой инвазии и уклонения от иммунного ответа. Для их детекции были сконструированы праймеры, нуклеотидные последовательности которых приведены в табл. 1.

Таблица 1. Праймеры для идентификации генов патогенности

№	Ген	Нуклеотидная последовательность, 5’–3’	Продукт, п. н.
1	fliJ	F: CAACTGGCGCAATTTCCAG	133
		R: GCAGGATTTCATACGAGCC
2	hppD	F: ATCAACTTCATCATCAACGCC	210
		R: CAGCGGTCGACGAAATAGAT
3	zmpB	F: GCAGTATCACTGGGTCTACA	311
		R: TACGTGCAGCTCTTGTTGT
4	rpoN	F: CACGAAAAGCATTCACGCTA	344
		R: CGAGCCGGTAGTAGAGATCG
5	LuxR	F: CAGCGACGACCTTGTTTATC	376
		R: CGATGCAGGTCGAGGTAATA
6	rpfF	F: GTGTTTCAACCAGCAACTCG	455
		R: GCAGTCTTCGTACCACTCTG
7	shvR	F: TTTCATCGGCACATTCGTTC	522
		R: TGATCGTACTGGCTGAAGTG
8	atsR	F: GTCGGAAGTGTCCCAATACT	574
		R: AGCTTGATGTAGTCGGTGAG
9	fliC	F: GTCGATGATTCAAACGGCAT	585
		R: GAGCGATTGCATTGGTGATT
10	mgtC	F: ATTTCGCACTCCGTCTTTTC	627
		R: GCTTTTCTCCATGCTCATCC
11	katB	F: AGAAGGACTGGGAAGTGAAC	677
		R: AGGTTCATCACCTTGTTCCA
12	katA	F: AGCAGAAGTACGGTCAGAAG	767
		R: GGGTTGTCCATGAAATGACG
13	zmpA	F: AGAAACTGTCTCGACTGCTG	920

Конструирование праймеров для ПЦР осуществляли в программе Primer-BLAST (National Library of Medicine, США). Специфичность праймеров проверяли с использованием алгоритма BLAST². Верификация специфичности полученных олигонуклеотидов производилась с помощью сервиса Standard Nucleotide BLAST («National Library of Medicine», США). Праймеры синтезировали в «Евроген» (Москва, Россия).

Для экстракции ДНК использовали суточную культуру, полученную при посеве на плотную питательную среду — селективный агар для выделения бактерий Burkholderia cepacia complex (OFPBL-agar, HiMedia). Бактериальную ДНК выделяли с помощью коммерческого набора «РИБО-Преп» (ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора) в соответствии с инструкцией производителя. Мультиплексирование праймеров проводили, ориентируясь на такие параметры, как условия проведения реакции и длину нарабатываемых фрагментов (табл. 2).

Таблица 2. Состав мультиплексов и амплификационной смеси

Мультиплекс	Состав ПЦР-смеси	Состав
1	Вода без нуклеаз — 8 мкл; ПЦР-микс 5X ScreenMix — 5 мкл; проба целевой ДНК — 2 мкл; праймеры — 1 мкл	fliJ (133 п. н.) rpoN (344 п. н.) shvR (522 п. н.) mgtC (627 п. н.) zmpA (920 п. н.)
2	Вода без нуклеаз — 10 мкл; ПЦР-микс 5X ScreenMix — 5 мкл; проба целевой ДНК — 2 мкл; праймеры — 1 мкл	hppD (210 п. н.) LuxR (376 п. н.) atsR (574 п. н.) katB (677 п. н.)
3	Вода без нуклеаз — 10 мкл; ПЦР-микс 5X ScreenMix — 5 мкл; проба целевой ДНК — 2 мкл; праймеры — 1 мкл	zmpB (311 п. н.) rpfF (455 п. н.) fliC (585 п. н.) katA (767 п. н.)

Для подбора условий проведения комплексной ПЦР ориентировались на рекомендации производителя реакционной смеси «Евроген». Общий объём реакционной смеси составил 25 мкл, компоненты реакционной смеси смешивали непосредственно перед проведением эксперимента.

Реакцию проводили на ДНК-амплификаторе CFX96 Touch («Bio-Rad») по следующей программе:

95°C, 5 мин — начальная денатурация;
95°C 30 с — денатурация;
57°C 30 с — отжиг;
72°C 1 мин — элонгация (34 цикла);
72°C 5 мин — финальная элонгация;
4°C — хранение.

Результаты реакции оценивали путём проведения горизонтального электрофореза в 1,5% агарозном геле с добавлением бромистого этидия.

На втором этапе исследования была проведена оценка встречаемости комбинаций генов, сгруппированных по выполняемым функциям: гены, связанные с бактериальной подвижностью и адгезией (fliC, fliJ, rpoN, shvR); гены, связанные с системами QS и биоплёнкообразованием (shvR, luxR, atsR, rpfF); гены, кодирующие факторы вирулентности, ассоциированные с уклонением от иммунного ответа, повреждением тканей и существованием в условиях дефицита микроэлементов (katA, katB, hppD, mgtC, zmpA, zmpB).

Статистическую обработку данных выполняли в среде Python 3.10 с использованием библиотек pandas, SciPy и Matplotlib в формате воспроизводимого Jupyter Notebook. Для сравнения частот встречаемости генов и их комбинаций между группами изолятов, выделенных до начала таргетной терапии (n = 32) и на фоне её применения (n = 119), для каждого признака формировали таблицу сопряжённости 2 × 2 и применяли двусторонний точный критерий Фишера. Данный критерий выбран, поскольку анализируемые признаки являются бинарными, а для ряда маркеров наблюдались малые или редкие частоты; в таких условиях точный критерий Фишера не требует выполнения асимптотических предпосылок χ²-критерия. Различия считали значимыми при p ≤ 0,05. Для описания неопределённости оценок дополнительно рассчитывали 95% доверительные интервалы Wilson для частот встречаемости маркеров в группах и 95% доверительные интервалы Newcombe–Wilson для разницы долей между группами. Результаты представлены в виде абсолютного числа положительных наблюдений, процента, 95% доверительного интервала и значения p.

Результаты

Детекция генов вирулентности изолятов

На рис. 1 представлена общая распространённость генетических детерминант 151 изолята B. cenocepacia.

Рис. 1. Распространённость генов, ассоциированных с продукцией факторов патогенности среди штаммов B. cenocepacia, и их комбинаций. Длина столбца — доля положительных наблюдений, горизонтальные усики — 95% доверительный интервал Wilson.

Гены, ассоциированные с бактериальной подвижностью и адгезией

Ген fliJ, ответственный за подвижность бактериальной клетки и её способность к инвазии, был детектирован у 102 (67,5%) изолятов, при этом у 23 (71,9%) штаммов, выделенных до начала таргетной терапии, и 79 (66,4%) штаммов — на фоне патогенетического лечения. Ещё один ген, ассоциированный с бактериальной подвижностью и способностью к адгезии — fliC, был выявлен у 34 (22,5%) штаммов. При этом 10 (31,3%) штаммов, выделенных от пациентов до начала приёма таргетной терапии, обладали большей подвижностью и высоким адгезивным потенциалом, а на фоне проводимого лечения их соотношение снизилось до 20,2%, что составило 24 штамма. Однако указанная тенденция не сопровождалась статистически достоверными различиями показателей.

Наличие гена сигма-фактора 54 rpoN, ассоциированного с бактериальной подвижностью и формированием биоплёнок, отмечалось менее чем у половины исследованных изолятов — 64 (42,4%), из них 15 (46,9%) получены из респираторных образцов до начала таргетной терапии, а 49 (41,2%) — на фоне лечения.

Гены rpoN, fliC и fliJ вовлечены в регуляцию и реализацию подвижности B. cenocepacia, комбинация всех 3 генов была выявлена у 22 (14,6%) изолятов. При этом среди изолятов, полученных до начала таргетной терапии, этот показатель был почти в 2 раза выше, чем в группе изолятов, полученных на фоне лечения — 8 (25,0%) и 14 (11,8%) соответственно. Данные различия характеризовались тенденцией к снижению показателей, близкой к статистически достоверной (p = 0,08).

Комбинация генов rpoN+fliC выявлена у 24 (15,9%) штаммов: до получения таргетной терапии — у 8 (25,0%) штаммов, а на фоне лечения — у 16 (13,4%). Комбинация генов rpoN+fliJ отмечена у 58 (38,4%), при этом не установлено различий у изолятов, полученных до и на фоне применения таргетной терапии — 14 (43,8%) и 44 (37,0%) соответственно.

Комбинация генов fliC+fliJ выявлена у 29 (19,2%) штаммов. При этом в группе изолятов, полученных до начала таргетной терапии, распространённость указанной комбинации составляла 10 (31,3%), а на фоне лечения — 19 (16,0%). Данные различия характеризовались тенденцией к снижению показателей, близкой к статистически достоверной (p = 0,07).

Комбинация генов fliC+shvR+rpoN зарегистрирована у 23 (15,2%) штаммов. При этом до начала лечения данная комбинация выявлена у 8 (25,0%) штаммов, а на фоне лечения — у 15 (12,6%).

Гены, ассоциированные с системами quorum sensing и биоплёнкообразованием

Ген shvR, ответственный за морфологию колоний и образование биоплёнок, так называемый «регулятор блестящего варианта», а также являющийся регулятором системы QS, экспрессии протеаз, липаз, белков системы секреции 2-го типа (ассоциация с адгезией, токсинообразованием, повреждением тканей), определяющий в конечном итоге переход от внутриклеточного персистирования к острой фазе воспаления обнаружен у 78 (51,7%) изолятов. Среди них 17 (53,1%) штаммов до начала получения таргетной терапии и 61 (51,3%) — на фоне её применения.

Интересными оказались результаты по наличию гена LuxR, который считается положительным регулятором таких вирулентных факторов, как система QS, выработка внеклеточных протеаз и бактериальная подвижность. Он выявлен лишь у 3 (2,0%) штаммов, из которых 2 (6,3%) получены до начала лечения, а 1 (0,8%) — на фоне его проведения. При этом отрицательный регулятор системы QS протеаз и бактериальной системы секреции 6-го типа, вовлечённой в конкурентное взаимодействие с другими бактериями (расчистка экологической ниши для собственной колонизации) — ген atsR встречался в 109 (72,2%) образцах. Как известно, удаление данного гена, являющегося сдерживающим, приводит к гиперпродукции факторов патогенности, включая протеазы и гены подвижности. Ген присутствовал в равной степени часто у штаммов до и на фоне проведения таргетной терапии — 24 (75,0%) и 85 (71,4%) соответственно.

Ген rpfF был обнаружен в 98 (64,9%) пробах и представлен в равной степени часто как у изолятов, выделенных до проведения таргетной терапии, — 20 (62,5%), так и на её фоне — 78 (65,5%). Кодируемый геном белок является координатором многоклеточной активности в рамках систем QS, регулируя совместные действия при достижении бактериальной популяцией пороговых значений. Кроме того, он связан с активацией вирулентности и устойчивостью бактерий в составе биоплёнок, способствует индукции протеолиза белков хозяина.

Ввиду крайне редкой встречаемости гена luxR в представленной выборке его сочетание с вышеуказанными генами встречалось лишь дважды: luxR+shvR или luxR+rpfF в штаммах, полученных до начала проведения таргетной терапии и после соответственно.

Комбинация генов rpoN+shvR отмечена у 57 (37,7%) изолятов. Не было установлено различий в группах штаммов до и на фоне лечения — 12 (37,5%) и 45 (37,8%) соответственно. Комбинация shvR+rpfF+atsR зарегистрирована у 61 (40,4%) изолята, из них в равной степени часто в группах до и на фоне терапии — 15 (46,9%) и 46 (38,7%). Эта же комбинация, но при отсутствии отрицательного регулятора вирулентности: shvR+rpfF–atsR отмечена у 6 (5,0%) изолятов, все они были выделены из проб, полученных на фоне проводимой таргетной терапии, однако это не сопровождалось статистически достоверными различиями.

Комбинация генов rpoN+rpfF+shvR+atsR выделена у 51 (33,8%) изолята, различий в группах до и на фоне проведения терапии не установлено, распространённость комбинации составляла 11 (34,4%) и 40 (33,6%) соответственно. Данная комбинация, но уже при отсутствии отрицательного регулятора вирулентности atsR (rpoN+rpfF+shvR– atsR), выделена лишь у 4 (3,4%) изолятов, все они были получены на фоне проводимого лечения, однако полученное незначительное увеличение вирулентности и образования биоплёнки не сопровождалось достоверными различиями.

Гены, кодирующие факторы вирулентности, ассоциированные с уклонением от иммунного ответа, повреждением тканей и существованием в условиях дефицита микроэлементов

Наличие гена mgtC, ответственного за способность к внутриклеточному выживанию и адаптации к дефициту ионов Mg²⁺, отмечено у 86 (57,0%) культур, в равной степени часто у штаммов, выделенных от пациентов до и на фоне таргетной терапии — 17 (53,1%) и 69 (58,0%) соответственно.

Ген, кодирующий синтез металлопротеиназы zmpA, ассоциированной с повреждением тканей и влиянием на факторы иммунной системы, присутствовал у 45 (29,8%) проб, из них у 9 (28,1%) до начала лечения и у 36 (30,3%) на фоне проводимой таргетной терапии. Ген zmpB, ассоциированный с вирулентностью, разрушением трансферрина, иммуноглобулинов, интерферона, коллагена IV типа и ряда иных антимикробных пептидов, присутствовал в 107 (70,9%) пробах, в равной степени часто у штаммов, полученных до и на фоне таргетной терапии — 22 (68,8%) и 85 (71,4%) соответственно.

Ген, ассоциированный с синтезом пигментов и способностью к интрамакрофагальному выживанию hppD, выявлен в 113 (74,8%) образцах. Распространённость гена определена в равной степени часто у изолятов, выделенных от пациентов до и на фоне таргетной терапии, составляя 24 (75,0%) и 89 (74,8%) соответственно. Отсутствие гена hppD или нарушение его экспрессии ассоциированы с повышенной чувствительностью к H₂O₂ и неспособностью противостоять фагоцитозу.

Ген katB, кодирующий основную пероксидазу, обеспечивающую защиту от активных форм кислорода, присутствовал у 30 (19,9%) штаммов, из них у 3 (9,4%) изолятов до терапии и 27 (22,7%) изолятов на фоне лечения. Ген katA, кодирующий каталазу, необходимую для защиты от действия H₂O₂ в условиях дефицита железа, и способность к росту в присутствии источников углерода, присутствовал у 71 (47,0%) образца, из них у 10 (31,3%) проб до лечения и 61 (51,3%) на фоне получаемой терапии. При этом у образцов, выделенных до начала таргетной терапии, этот ген встречался достоверно реже (p < 0,05).

Комбинация генов, ответственных за комплекс факторов, обеспечивающих уклонение от иммунного ответа — hppD+mgtC+zmpA+zmpB, выделена у 36 (23,8%) изолятов: у 6 (18,8%) штаммов до начала терапии и у 30 (25,2%) на фоне терапии.

Комбинация zmpA+zmpB была выявлена у 44 (29,1%) проб, из них 8 (25,0%) штаммов до терапии и 36 (30,3%) штаммов на фоне лечения. Комбинация генов zmpA+zmpB и shvR выявлена у 41 (27,2%) изолята, при этом не было установлено различий в зависимости от получения терапии: 7 (21,9%) до лечения и 34 (28,6%) на фоне терапии.

Комбинация hppD+mgtC встречалась у 80 (53,0%) штаммов, это соотношение практически не менялось на фоне терапии. До начала лечения данная комбинация встречалась у 17 (53,1%) штаммов, а после начала лечения — у 63 (52,9%).

Однако комбинация mgtC+fliC, ассоциированная с выживанием в макрофагах и потерей подвижности, встречалась у 62 штаммов, из которых в 25,0% случаев — до применения таргетной терапии с повышением встречаемости до 45,4% штаммов на её фоне, что сопровождалось статистически достоверными различиями (p < 0,05). Также стоит отметить, что схожая тенденция к возрастанию наблюдалась у сочетания генов mgtC-rpoN с динамикой значений показателей с 18,8 до 28,6%, однако указанные различия не были статистически достоверными.

Гены, ассоциированные с защитой от окислительного стресса — hppD+katA, встречались у 10 (31,3%) штаммов, выделенных до начала терапии, и у 60 (50,4%) штаммов на фоне применяемого лечения. Данные различия характеризовались тенденцией к повышению показателей, близкой к статистически достоверной (p = 0,07).

Комбинация генов, опосредующих выживание бактерий в условиях дефицита магния и железа — katA+mgtC, встречалась у 55 (36,4%) штаммов. Указанная способность в большей степени была выражена для штаммов, выделенных на фоне проведения таргетной терапии, — у 48 (40,3%) штаммов против 7 (21,9%) штаммов до начала лечения. Данная тенденция к адаптации штаммов к изменяющимся микроэкологическим условиям на фоне применения препаратов таргетной терапии и способности к персистенции внутри фагоцитов сопровождается различиями, близкими к статистически достоверным (р = 0,06).

На рис. 2 представлена диаграмма, отображающая изменение генетического профиля штаммов до и на фоне начала применения таргетной терапии.

Рис. 2. Распространённость комбинаций генов, ответственных за продукцию определённых групп факторов патогенности, у штаммов B. cenocepacia, выделенных до и на фоне применения препаратов таргетной терапии. ТТ — таргетная терапия; n — число штаммов.

Обсуждение

Объектом данного исследования стали изоляты B. cenocepacia, которые являются наиболее частой причиной развития хронической бронхолёгочной инфекции у пациентов с МВ и обладают угнетающим действием на функцию дыхания. Полученные нами данные свидетельствуют о высокой распространённости у B. cenocepacia комплекса генов, ассоциированных с подвижностью, биоплёнкообразованием, внутриклеточным выживанием, устойчивостью к окислительному стрессу и продукцией факторов повреждения тканей. В целом выявленный профиль вирулентности соответствует современным представлениям о B. cenocepacia как о высокоадаптированном оппортунистическом патогене, способном эффективно колонизировать дыхательные пути больных МВ и персистировать в условиях хронического воспаления [5, 14]. По результатам сравнения генетических профилей изолятов B. cenocepacia, полученных из биоматериала пациентов с МВ до начала применения таргетной терапии и на её фоне на протяжении 36 мес, можно говорить об изменениях встречаемости большинства исследованных генов в популяциях микроорганизмов, обитающих в дыхательных путях.

B. cenocepacia использует систему QS для регуляции экспрессии генов, кодирующих факторы вирулентности, в зависимости от плотности бактериальной популяции [22]. Одной из QS-систем, выделенных у B. cenocepacia, является система RpfFR, зависящая от сигнальной молекулы — цис-2-додеценовой жирной кислоты, называемой Burkholderia diffusible signal factor. В экспериментальных условиях зарубежных авторов продемонстрировано, что снижение экспрессии генов rpfF и rpfR, кодирующих структурные компоненты данной сигнальной системы, влечёт за собой снижение подвижности бактериальных клеток, протеолитической активности и образования биоплёнок в микротитрационных планшетах [23–25]. Кроме того, для B. cenocepacia описана QS-система LuxI-LuxR типа, составными компонентами которой являются синтетаза LuxI и транскрипционный регулятор LuxR [26]. Не менее значимым фактором патогенности B. cenocepacia является ShvR — глобальный транскрипционный регулятор LysR-типа, контролирующий процесс экспрессии более тысячи генов и принимающий участие в изменении морфологии бактериальных колоний, образовании биоплёнок и взаимодействии с компонентами QS-систем [27]. В литературе показано, что подобные регуляторы играют важную роль в переключении бактерии между персистирующим внутриклеточным состоянием и фазой активного повреждения тканей хозяина. Выявление генов shvR и atsR у значительной доли изолятов демонстрирует сохранение сложных регуляторных сетей, контролирующих морфологию колоний, QS, продукцию протеаз, липаз и компонентов систем секреции. Высокая распространённость гена rpfF у исследованных изолятов подтверждает участие системы QS и связанных с ней сигнальных путей в регуляции вирулентности B. cenocepacia.

Для регуляции образования биоплёнки, организация которой является одним из ключевых механизмов длительной персистенции B. cenocepacia в бронхолёгочной системе, необходим альтернативный сигма-фактор σ54 (RpoN) [28]. Кроме того, RpoN участвует в замедлении слияния фаголизосом, обеспечивая внутриклеточное выживание B. cenocepacia в макрофагах [29]. Несмотря на значимость гена rpoN для персистенции бактерий, в нашем исследовании ген был выявлен менее чем у половины изолятов B. cenocepacia.

В нашем исследовании у штаммов, выделенных на фоне применения таргетной терапии, не наблюдалось значимого изменения встречаемости генов-регуляторов систем QS и образования биоплёнки. Данные результаты могут указывать на то, что CFTR-модуляторы сами по себе не снижают уже сформированный патогенный потенциал B. cenocepacia, а лишь изменяют условия его реализации. Полученные данные по исследованию комбинации генов rpoN, rpfF, shvR, luxR и atsR, связанных с системами QS и биоплёнкообразованием, указывают на высокую сохранность и консервативность регуляторных сочетаний данных генов у B. cenocepacia, независимо от этапа таргетной терапии.

В процессе выживания B. cenocepacia внутри фагоцитов важна защита от окислительного стресса и губительного действия свободных радикалов. Данный процесс обеспечивается различными механизмами, одним из которых является синтез пигмента с антиоксидантными свойствами, нейтрализующего H₂O₂ и супероксидный радикал-анион. В его продукции участвует фермент 4-гидроксифенилпируват-диоксигеназа, кодируемый геном hppD, катализирующий превращение 4-гидроксифенилпирувата в гомогентизат — ключевой промежуточный продукт для образования пиомеланина [30, 31]. В нашем исследовании высокая частота распространённости гена hppD указывает на сохранение механизмов защиты патогена от окислительного стресса, поскольку нарушения в этом локусе ассоциированы с повышенной чувствительностью к H₂O₂и снижением способности противостоять фагоцитозу.

Следует отметить изменения в экспрессии генов, кодирующих продукцию факторов патогенности. B. cenocepacia продуцируют две цинк-зависимые металлопротеазы — ZmpA и ZmpB, кодируемые генами zmpA и zmpB соответственно [32]. Они позволяют возбудителю уклоняться от факторов иммунной системы макроорганизма путём расщепления антимикробных пептидов, а также нарушать целостность тканей [33]. Известно, что протеаза ZmpA расщепляет не только компоненты иммунной системы, а именно γ-интерферон, интерлейкин-37, элафин, α₁-протеиназный ингибитор, α₂-макроглобулин, но и белки внеклеточного матрикса — коллаген IV типа, фибронектин [34]. Металлопротеаза ZmpB расщепляет иммуноглобулин человека, β-дефензин-1 и лактоферрин [33]. Экспериментальным путём на лабораторных животных продемонстрировано, что ZmpA и ZmpB необходимы для реализации патогенных свойств B. cenocepacia и персистенции, поскольку удаление генов, кодирующих данные металлопротеазы, приводит к снижению интенсивности повреждения лёгочной ткани и более быстрой элиминации возбудителя из организма хозяина [33, 34]. В нашем исследовании на фоне лечения наблюдалось увеличение частоты встречаемости генов zmpA и zmpB. Поскольку ZmpA и ZmpB ассоциированы с повреждением тканей и уклонением от иммунного ответа, их более частое выявление может указывать на селекционное преимущество штаммов с выраженным протеолитическим потенциалом в условиях изменённого иммунологического фона после начала таргетной терапии [35]. Это позволяет предположить, что CFTR-модуляция не только улучшает клиническое состояние пациента, но и формирует новую экологическую нишу, в которой персистируют более приспособленные бактериальные субпопуляции.

В обеспечении антиоксидантной защиты микробных клеток важную роль играют каталазы, продуцируемые B. cenocepacia. Среди них выделяют специализированную каталазу/пероксидазу, кодируемую геном katA и поддерживающую нормальную активность цикла трикарбоновых кислот, и классическую каталазу/пероксидазу, кодируемую геном katB и необходимую для защиты клеток от окислительного стресса посредством нейтрализации Н₂О₂ [36]. В нашем исследовании на фоне применения препаратов таргетной терапии показано достоверное увеличение распространённости гена katA, кодирующего каталазу, необходимую для защиты от действия Н₂О₂ в условиях железодефицита. Распространённость гена katB у изолятов B. cenocepacia, выделенных на фоне таргетной терапии выше, что может быть свидетельством адаптации к изменяющимся микроэкологическим условиям, однако это не сопровождается статистически достоверными различиями. В литературе описано, что инактивация генов, кодирующих каталазы, приводит к гиперчувствительности к Н₂О₂ и снижению роста микробных клеток [36]. Данные зарубежных авторов демонстрируют снижение функциональной активности фагоцитов у пациентов с МВ, что может приводить к нарушению механизмов NADPH-оксидаз-зависимого образования активных форм кислорода. К. Assani и соавт. показали, что инфицирование B. cenocepacia дополнительно усугубляет этот дефект и может способствовать персистенции инфекции при МВ [37]. Повышение распространённости генов katA и katB у изолятов B. cenocepacia на фоне таргетной терапии, вероятно, отражает адаптацию бактерии к изменившейся иммунной среде дыхательных путей. По мере частичной нормализации фагоцитарной функции под влиянием CFTR-модуляторов возрастает эффективность кислородзависимых механизмов микробицидной защиты, включая образование активных форм кислорода. В этих условиях селективное преимущество получают изоляты B. cenocepacia, способные за счёт усиленной каталазной активности противостоять окислительному стрессу.

Полученные результаты по гену mgtC согласуются с данными K.E. Maloney и соавт., показавших, что данный ген необходим для роста бактерии в условиях дефицита магния и для выживания внутри макрофагов. Высокая частота встречаемости mgtC в исследованных изолятах подтверждает значимость внутриклеточного этапа персистенции B. cenocepacia у больных МВ [38].

В целом результаты нашего исследования демонстрируют тенденцию к увеличению частоты встречаемости штаммов с генами, ассоциированными с возможностью выживания внутри фагоцитов и устойчивостью к окислительному стрессу (katA, katB, mgtC, rpfF, zmpA, zmpB), на фоне таргетной терапии, что, вероятно, связано со сменой их стратегии выживания на сценарий острого воспаления с переходом в формат персистентной инфекции.

B. cenocepacia относится к подвижным микроорганизмам благодаря наличию жгутиков [12]. Эти структуры микробной клетки необходимы не только с целью распространения бактерий в организме хозяина, но и для инвазии эпителиальных клеток дыхательных путей и формирования биоплёнок [13, 39]. Кроме того, жгутики B. cenocepacia участвуют в развитии хемокинового и цитокинового ответа как in vitro, так и in vivo посредством взаимодействия с Toll-подобным рецептором-5 (TLR5) [40]. Стоит отметить, что в пределах вида B. cenocepacia существуют субпопуляции бактерий с различными фенотипическими вариантами жгутиковой системы, что зависит от условий окружающей среды, стадии жизненного цикла и способа культивирования [41]. При посеве мокроты пациентов с МВ с хронической колонизацией респираторного тракта B. cenocepacia у данного патогена наблюдалось усиление экспрессии генов, кодирующих белки жгутиков, в частности гена fliC, отвечающего за синтез основного структурного компонента — флагеллина. Полученные результаты связывают с условиями, существующими в дыхательных путях пациентов, болеющих МВ, а именно с наличием густого вязкого бронхиального секрета, богатого аминокислотами и углеводами, являющимися питательными веществами для B. cenocepacia [42]. Исследование В. Kumar и соавт. только подтвердило данный факт в условиях синтетической среды для МВ (synthetic cystic fibrosis mucus), имитирующей мокроту пациентов. При этом авторы отметили повышение уровня экспрессии генов жгутиков, что привело к изменению морфотипа бактериальных клеток (увеличению количества жгутиков) и, как следствие, к повышению подвижности патогена. В то же время продемонстрировано, что при культивировании B. cenocepacia в минимальной среде с отдельными аминокислотами (аргинин, глутамат, гистидин, фенилаланин, пролин) подвижность бактерий возрастает за счёт хемотаксиса без изменения уровня экспрессии флагеллина [41]. Важным компонентом жгутикового аппарата B. cenocepacia является белок FliJ, кодируемый геном fliJ³; он входит в состав экспортного аппарата системы секреции III типа, необходимого для сборки жгутика за пределами микробной клетки [43, 44]. В нашем исследовании при оценке встречаемости генов-регуляторов подвижности у штаммов B. cenocepacia наблюдается тенденция к её снижению на фоне применения таргетной терапии. При длительной персистенции B. cenocepacia в дыхательных путях пациентов с МВ экспрессия генов жгутиков может подавляться, что рассматривается как адаптивная стратегия, направленная на уклонение микроорганизма от иммунного ответа хозяина в условиях хронической инфекции [44]. У изолятов B. cenocepacia, выделенных от пациентов с МВ, на фоне таргетной терапии отмечалась тенденция к снижению распространённости комбинаций генов, связанных с бактериальной подвижностью, прежде всего сочетаний rpoN+fliC и fliC+fliJ. Наиболее выраженное снижение наблюдалось для комбинации всех 3 генов (rpoN, fliC и fliJ), частота которой до начала лечения была почти в 2 раза выше, чем на фоне терапии.

На фоне применения препаратов таргетной терапии отмечается тенденция к снижению распространённости генов, ассоциированных с адгезией (p = 0,09).

Заключение

Таким образом, по результатам сравнения генетических профилей бактерий B. cenocepacia, полученных из биоматериала пациентов до лечения и на протяжении 36 мес таргетной терапии МВ, можно говорить об изменениях встречаемости большинства исследованных генов в популяциях микроорганизмов, обитающих в дыхательных путях. В частности, на фоне лечения наблюдается тенденция к увеличению частоты встречаемости штаммов с генами, ассоциированными с возможностью выживания внутри фагоцитов и устойчивостью к окислительному стрессу (katA, katB, mgtC, rpfF, zmpA, zmpB), что, вероятно, связано со сменой их стратегии выживания на сценарий острого воспаления с переходом в формат персистентной инфекции. При этом у изолятов, выделенных до начала таргетной терапии, ген katA, кодирующий каталазу с целью защиты от действия H₂O₂ в условиях дефицита железа, встречался статистически достоверно реже (p < 0,05). Гены fliJ и rpoN, ассоциированные с подвижностью и образованием биоплёнок, встречались в равной степени часто в группах до и на фоне лечения, в то время как частота встречаемости гена fliC уменьшилась на фоне таргетной терапии, но указанная тенденция не сопровождалась достоверными различиями показателей. Ген hppD, ассоциированный со способностью к внутримакрофагальному выживанию и пигментообразованию, детектирован в равной степени часто у изолятов, выделенных от пациентов до и на фоне таргетной терапии. Более высокая распространённость гена katB у изолятов, выделенных на фоне таргетной терапии, может быть свидетельством адаптации патогена к изменяющимся микроэкологическим условиям дыхательной системы, однако это не сопровождалось статистически достоверными различиями. При оценке встречаемости комбинации генов-регуляторов подвижности у изолятов B. cenocepacia (fliC+fliJ, rpoN+fliC) наблюдается тенденция к её снижению на фоне применения таргетной терапии. При анализе наличия комбинации генов, связанных с системами QS и биоплёнкообразованием (rpoN, rpfF, shvR, luxR и atsR), у штаммов, выделенных на фоне применения таргетной терапии, не наблюдалось значимого изменения их встречаемости. На фоне лечения отмечается статистически достоверное увеличение способности к выживанию в условиях дефицита магния, а также снижению подвижности штаммов B. cenocepacia. Комбинация генов mgtC+fliC, ассоциированная с интрамакрофагальным выживанием и потерей подвижности, отмечена у 25,0% штаммов до начала лечения, с последующим увеличением встречаемости до 45,4%, что сопровождалось статистически достоверными различиями (p < 0,05). Также показана тенденция к снижению распространённости генов, ассоциированных с адгезией, на фоне таргетной терапии.

¹ Кистозный фиброз (муковисцидоз): клинические рекомендации / Союз педиатров России, Ассоциация медицинских генетиков, Российское респираторное общество и др. URL: https://cr.minzdrav.gov.ru/preview-cr/372_3 (дата обращения: 15.04.2026).

² URL: https://blast.ncbi.nlm.nih.gov

³ fliJ gene. URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/6933591 (дата обращения: 15.04.2026).