Determination of the Bordetella pertussis genotype by the ptxP, fim3, and prn loci from clinical samples in 2023–2025

Full Text

Введение

Коклюш, вызываемый Bordetella pertussis, является глобально распространённым инфекционным заболеванием. Несмотря на то что коклюш можно предотвратить с помощью вакцинации, он по-прежнему вызывает вспышки и более тяжело протекает у младенцев в возрасте до 6 мес, особенно у тех, кто не был привит или был привит частично [1]. Всплеск заболеваемости коклюшем может быть вызван генотипическими вариациями в основных протективных антигенах в циркулирующих штаммах B. pertussis, что могло привести к появлению новых генетических вариантов микроорганизма. Исследования показали, что цельноклеточные (ЦКВ) и бесклеточные коклюшные вакцины (БКВ) оказывают селективное давление на популяцию B. pertussis [2]. Например, штаммы B. pertussis, несущие аллельный вариант ptxP3, распространены в странах, где используются БКВ [3].

В России для вакцинации от коклюша применяются как ЦКВ, так и БКВ. Вакцинация регламентируется Национальным календарём профилактических прививок. В настоящее время для изучения особенностей генетической структуры основных факторов патогенности штаммов B. pertussis необходимо выделение бактериальной культуры B. pertussis. Культивирование занимает длительное время — до 7 сут. При этом общая эффективность бактериологического исследования составляет 20%, что связано с биологическими особенностями возбудителя, а также с приёмом антибактериальных препаратов.

Одним из методов, используемых для геномного мониторинга за возбудителем коклюша, является мультилокусное антигенное сиквенс-типирование (MAST). Данный метод основан на секвенировании фрагментов основных протективных антигенов возбудителя, что позволяет выявлять генетические различия и оценивать клональный состав циркулирующей популяции B. pertussis. Это позволяет идентифицировать гены, кодирующие белки, включённые в состав БКВ [4]. MAST изначально было разработано для изучения изменений в популяции B. pertussis и основывалось на типировании генов поверхностных антигенов, выделенных из бактериальных культур [5–8]. MAST фокусируется на генах, кодирующих 5 белков, используемых в современных вакцинах против коклюша: коклюшный токсин (PT), филаментозный гемагглютинин, пертактин (PRN), фимбрии 2-го и 3-го типов (Fim2 и Fim3). Промотор PT (ptxP) также используется для типирования изолятов, поскольку предполагается, что вариант ptxP3 усиливает продукцию токсина [9]. Все современные вакцины против коклюша содержат PT, остальные компоненты используются в различных сочетаниях [10].

В данной работе мы представляем способ генотипирования с использованием вложенной полимеразной цепной реакции (nested-ПЦР), которая позволяет проводить типирование по схеме MAST (ptxP-fim3-prn) напрямую из клинических образцов, исключая выделение бактериальной культуры.

Целью настоящего исследования явилось определение генетических вариантов B. pertussis по промотору РТ ptxP, гену fim3, гену пертактина prn в клинических образцах, полученных в 2023–2025 гг. с использованием nested-ПЦР и секвенирования по Сэнгеру.

Материалы и методы

В работе использованы мазки, взятые с задней стенки глотки у больных коклюшем и полученные из лабораторий медицинских организаций и ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» в субъектах РФ. Исследование проводилось в рамках работы Референс-центра по мониторингу за коклюшем при добровольном информированном согласии пациентов или их законных представителей. Протокол исследования одобрен Комитетом по биомедицинской этике ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора (протокол № 63 от 22.12.2022).

Возбудитель коклюша в биологическом материале определяли методом ПЦР в режиме реального времени с помощью наборов реагентов «АмплиСенс Bordetella multi-FL» (ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора), «АмплиПрайм Bordetella» («НекстБио») и «РеалБест ДНК Bordetella species/Bordetella pertussis/Bordetella bronchiseptica» («Вектор-Бест»). Для амплификации ДНК использовали приборы: «Rotor-Gene Q 5 plex HRM» («Qiagen GmbH») и ДТ-прайм («НПО ДНК-Технология»).

Для выявления фрагментов генов ptxP, fim3, prn использовали nested-ПЦР, представляющую собой ПЦР, состоящую из 2 этапов. Сначала амплифицировали участок, включающий в себя целевой фрагмент ДНК и фланкирующие его последовательности, к которым отжигается первая пара праймеров: для ptxP — PtxP1wide и PtxP2wide; для fim3 — Fim3Fwide и Fim3Rwide (табл. 1). На 2-м этапе добавляли праймеры, комплементарные концам целевого фрагмента, полученного на 1-м этапе: для ptxP — PtxP1 и PtxP2; для fim3 — Fim3F и Fim3R. Ген пертактина* (prn) был амплифицирован в один этап ПЦР.

 

Таблица 1. Праймеры, используемые в ПЦР-исследовании для выявления генов

Ген	Праймер	Нуклеотидная последовательность 5’–3’	Ориентация праймера	Размер продукта, п. н.	Назначение		Примечание
ptxP	PtxP1wide	ATATCCCGAATTCGTCGCCT	Прямой праймер	714	1-й раунд	Амплификация	Оригинальный
	PtxP2wide	GAGCACATTGTCGTTGTTTCC	Обратный праймер
	PtxP1	AATCGTCCTGCTCAACCGCC	Прямой праймер	573	2-й раунд	Амплификация/секвенирование	[9]
	PtxP2	GGTATACGGTGGCGGGAGGA	Обратный праймер
fim3	Fim3Fwide	CATGCTAATGGCCTCCGGT	Прямой праймер	900	1-й раунд	Амплификация	Оригинальный
	Fim3Rwide	GCGTGCTGAAGGACAAGATGG	Обратный праймер
	Fim3F	GACCTGATATTCTGATGCCG	Прямой праймер	715	2-й раунд	Амплификация/секвенирование	[11]
	Fim3R	CGCAAGGCTTGCCGGTTTTTTTTG	Обратный праймер
prn-region 1*	prn-AF	GCCAATGTCACGGTCCAA	Прямой праймер	585		Амплификация/секвенирование	[12]
	prn-AR	GCAAGGTGATCGACAGGG	Обратный праймер

 

Условия проведения nested-PCR описаны в разделе «Результаты».

Ферментативная очистка ПЦР-продукта была проведена набором «Exo-Sap Express PCR Product Cleanup reagent» («Applied Biosistems by TermoFisher Scientific»). Реакцию секвенирования с общим объёмом реакционной смеси 20 мкл: деионизированная H₂O 6,68 мкл, праймеры (10 пмоль/мкл) 0,32 мкл, Q solution 4 мкл («Invitrogen»), 5× sequencing buffer 7 мкл («Invitrogen»), «Big Dye terminator v. 3.1» 1 мкл, ПЦР-продукт 1 мкл проводили в «ABI Applied Biosystems 9902 Veriti PCR Thermal Cycler» («Thermo Scientific») по следующей программе: 96°C 1 мин; затем 25 циклов: 96°C 10 с, 50°C 5 с, 60°C 4 мин. Затем проводили очистку продуктов реакции с помощью набора «Big Dye Xterminator Purification kit» («Applied Biosistems»).

Секвенирование по Сэнгеру всех 3 мишеней выполняли с тех же праймеров, которые применяли на втором раунде амплификации: ptxP — внутренние праймеры PtxP1 и PtxP2 (продукт 573 п. н.); fim3 — внутренние праймеры Fim3F и Fim3R (продукт 715 п. н.); prn — праймеры, использованные в однораундовой ПЦР (прямой и обратный для региона 1 гена prn, перечислены в табл. 1).

Каждый образец секвенировали в прямом и обратном направлении для получения консенсусной последовательности и исключения ошибок амплификации/секвенирования. Капиллярный электрофорез проводили в генетическом анализаторе «3500 Applied Biosystems» («Thermo Scientific»). Анализ хроматограмм проводили в программе MEGA 11.0¹. Для всех нуклеотидных последовательностей использовали Phred-подобный порог качества ≥ 20 (вероятность ошибки ≤ 1%); визуальное подтверждение однозначности пиков (отсутствие двойных пиков, шумов); полное совпадение прямого и обратного прочтений; длину консенсусной последовательности не менее 95% ожидаемого размера ампликона. Последовательности, не удовлетворяющие этим критериям, из анализа исключали. Итоговые аллели определяли путём выравнивания на референсные последовательности B. pertussis (ptxP3 (FN252324.1), fim3-1 (AY464179.1), fim3-2 (AY464180.1), prn2 (AJ011092.1) и сравнения с известными аллельными вариантами по базе данных BIGSdb-Pasteur².

Описательная статистика представлена в виде медианы и межквартильного размаха (IQR). Сравнение групп по значениям Ct проводили с использованием двустороннего U-критерия Манна–Уитни.

Результаты

Выявление фрагмента промотора коклюшного токсина (ptxP)

Для выявления фрагмента промотора ptxP РТ при проведении nested-ПЦР в 1-м раунде для амплификации фрагмента ДНК размером 714 п. н. использовали внешние праймеры (табл. 1). Во 2-м раунде на основе 1-й амплификации с использованием внутренних праймеров проводили амплификацию целевого фрагмента размером 573 п.н. Реакционная смесь 1-го и 2-го раундов содержала 10×ПЦР (NH₄)₂SO₄, 25 мM MgCl₂, 2 мM dNTPs (все буферные растворы «Thermo Scientific»), 5M Betaine solution («Sigma-Aldrich»), Tag DNA Polymerase («Thermo Scientific»), праймеры в конечной концентрации не ниже 5 пкмоль/мкл. Амплификацию фрагментов нуклеотидных последовательностей проводили в термоциклере «Терцик» («НПО ДНК-Технология») при следующих условиях: 95°С 10 мин, 30 циклов 95°С 15 с, 55°С 30 с, 72°С 1 мин, 72°С 10 мин. Детекцию результата амплификации проводили путём постановки горизонтального электрофореза в 1,5% агарозном геле при 160 В в течение 1 ч с последующим сравнением электрофоретической подвижности специфических светящихся фрагментов амплифицированных продуктов с подвижностью фрагментов маркера молекулярных весов «Thermo Scientific GeneRuller 50 bp DNA Ladder» («Thermo Scientific»). Визуализацию проводили с помощью гель-документирующей системы «Quantum-ST41100/26M». Электрофоретический анализ продуктов nested-ПЦР в 1,5% агарозном геле выявил наличие чёткой полосы размером 714 п. н. после 1-го раунда амплификации и 573 п. н. — после 2-го (ожидаемые размеры). Посторонние полосы не детектировались. Контрольный образец без матрицы (ПЦР-смесь) не содержал видимых продуктов, что указывало на отсутствие контаминации и специфичность реакции.

Выявление фрагмента гена fim3

Для выявления фрагмента гена fim3 при проведении nested-ПЦР в 1-м раунде для амплификации фрагмента ДНК размером 900 п. н. использовали внешние праймеры (табл. 1). Во 2-м раунде на основе 1-й амплификации с использованием внутренних праймеров проводили амплификацию целевого фрагмента размером 715 п. н. Состав реакционной смеси 1-го и 2-го раундов описан выше. Амплификацию проводили с помощью прибора «Терцик» («ДНК-технология») при следующих условиях: 95°С 15 мин, 30 циклов 95°С 30 с, 56°С 30 с, 72°С 1 мин. При электрофорезе в 1,8% (1-й раунд) и 1,5% (2-й раунд) агарозных гелях регистрировали фрагменты размером 900 и 715 п. н. соответственно. Неспецифических полос не наблюдали ни в одном из раундов. Отрицательный контроль (ПЦР-смесь без матрицы) оставался свободным от продуктов амплификации, подтверждая отсутствие контаминации.

Выявление фрагмента гена prn

Полиморфизм гена prn, определяющий основные аллельные варианты (prn1, prn2, prn3 и др.), сосредоточен преимущественно в вариабельном регионе 1 (5'-область гена, содержащая повторяющиеся последовательности). Амплифицируемый в нашей работе фрагмент размером 585 п. н. охватывает именно этот участок, что позволяет определять аллели путём последующего секвенирования. Амплификацию проводили с помощью прибора «Терцик» («ДНК-технология») при следующих условиях: 95°С 15 мин, 30 циклов 95°С 15 с, 55°С 30 с, 72°С 1 мин и 72°С 10 мин. Состав реакционной смеси и детекция результатов амплификации были аналогичны описанным выше. Однораундовая ПЦР с последующей детекцией в 1,5% агарозном геле давала продукт размером 585 п. н., что соответствует целевому фрагменту гена prn. Посторонние полосы отсутствовали. Отрицательный контроль (реакционная смесь без ДНК-матрицы) был чистым, свидетельствуя об отсутствии контаминации.

Таким образом, результаты электрофореза подтвердили наработку целевых фрагментов для последующего секвенирования по Сэнгеру.

Из 428 проанализированных образцов результаты секвенирования на основе ПЦР были получены для ptxP в 97,9% (419/428) образцов, для fim3 в 31,1% (133/428), для prn в 27,6% (118/428) (рис. 1). Идентифицированными аллелями B. pertussis были ptxP3 в 99,5% (418/420) секвенированных образцов, ptxP2 в 0,5% (2/420), для fim3-1 в 82,7% (110/133), fim3-2 в 16,5% (22/133), fim3-3 в 0,8% (1/133), из prn-положительных образцов 94,1% (111/118) содержали аллель prn2, 2,5% (3/118) — prn3, по 1,7% (2/118) — prn1 и prn9.

 

Рис. 1. Частота выявления аллелей основных протективных антигенов B. pertussis в образцах мазков из ротоглотки (n = 428). Аллельные варианты представлены в виде процента от общего числа генов, обнаруженных в клинических образцах.

 

Из 428 образцов в 79 был получен полный аллельный профиль по схеме ptxP-fim3-prn. Были выявлены 6 генотипов. Генотип ptxP3-fim3-1-prn2 преобладал по всей стране (75,9%), генотип ptxP3-fim3-2-prn2 встречался реже (16,5%) и был обнаружен в 8 субъектах РФ. В единичных случаях встречались ptxP3-fim3-1-prn3 (2,5%), ptxP3-fim3-1-prn9 (2,5%), ptxP3-fim3-1-prn1 (1,3%), ptxP3-fim3-3-prn2 (1,3%) (рис. 2).

 

Рис. 2. Распределение генотипов B. pertussis, циркулирующих на территории России в 2023–2025 гг.

 

Проведённые исследования показали, что использование разработанного способа генотипирования B. pertussis на основе nested-ПЦР позволяет наработать целевые фрагменты напрямую из клинических образцов, которые подвергают MAST-типированию с целью идентификации аллельных вариантов фрагментов промотора ptxP РТ, фимбрий 3-го типа fim3 и пертактина prn.

Для каждого гена сравнивали значения пороговых циклов (Ct) в группах образцов, где электрофорез (амплификация целевого фрагмента для генотипирования) «получился» и «не получился» (табл. 2). Анализ выполнен с помощью U-критерия Манна–Уитни.

 

Таблица 2. Сравнение значений пороговых циклов (Ct) в группах образцов с успешным и неуспешным генотипированием генов ptxP, fim3 и prn (U-критерий Манна–Уитни)

Ген	Группа	n	Медиана Ct	IQR	U-критерий	p
ptxP	Успешное генотипирование	419	18,2	15,2–21,8	62,0	< 0,0001
	Неуспешное генотипирование	9	25,1	23,3–26,9
fim3	Успешное генотипирование	133	13,7	11,2–15,9	144,5	< 0,0001
	Неуспешное генотипирование	295	20,5	17,4–22,9
prn	Успешное генотипирование	118	12,5	10,9–15,3	56,0	< 0,0001
	Неуспешное генотипирование	310	20,1	17,1–22,8

 

Во всех трёх локусах образцы, для которых не удалось получить продукт генотипирования, имели значительно более высокие значения Ct (т. е. более низкую концентрацию ДНК возбудителя), чем образцы с успешным генотипированием. Эти различия являются статистически значимыми, что объективно подтверждает связь между низкой бактериальной нагрузкой и ограниченной выявляемостью аллелей fim3 и prn.

Обсуждение

B. pertussis является сложным для выделения микроорганизмом, поскольку на его жизнеспособность влияют различные факторы, в том числе своевременный сбор и транспортировка образцов, особые требования к культивированию, а также приём антибиотиков от коклюша во время лечения [11]. Современные методы типирования основаны на выделении патогена, что ограничивает понимание генотипического разнообразия. В этом исследовании мы определяли аллельные профили B. pertussis, циркулировавшие в России в 2023–2025 гг., с помощью разработанного способа генотипирования без выделения бактериальной культуры, основанного на использовании nested-ПЦР и секвенирования по Сэнгеру генов основных протективных антигенов (ptxP, fim3 и prn) непосредственно из образцов мазков из ротоглотки.

Мы обнаружили аллельный вариант ptxP3 в 97,9% клинических образцов, проанализированных на наличие ptxP (419/428), для fim3 в 31,1% (133/428) и для prn в 27,6% (118/428) образцов. Среди 11 аллельных вариантов ptxP (ptxP1–ptxP11) ptxP3 распространён во всём мире [9, 13]. Аллель ptxP3 была обнаружена в США [14], Мексике [15], Аргентине [16], Австралии [17], Китае [18], Японии [19], Южной Африке [20] и разных европейских странах, включая Италию, Францию, Испанию и Бельгию [21]. Было отмечено, что штаммы B. pertussis, несущие аллельный вариант ptxP3, связаны с повышенной выработкой РТ [9, 22]. Экспериментальные данные также указывают на то, что штаммы ptxP3 обладают конкурентным преимуществом перед другими вариантами [23], что может объяснить их широкое распространение на территории России.

Ген prn B. pertussis кодирует белок пертактин, который является важным фактором вирулентности и компонентом БКВ. В структуре этого гена выделяют два основных полиморфных участка, обозначаемых как регион 1 и регион 2. Регион 1 — это вариабельный участок в 5'-области гена, характеризующийся наличием повторяющихся последовательностей (GGX-повторов) и точечных мутаций. Именно он определяет основные аллельные варианты prn: prn1, prn2, prn3 и редкие prn4, prn5, prn9 и др. Кроме того, в этом регионе часто происходят делеции, приводящие к преждевременному стоп-кодону и полной утрате продукции пертактина. Регион 2 расположен ближе к 3'-концу гена и менее вариабелен; его полиморфизм, как правило, не используется для рутинного аллельного типирования. Ген prn имеет глобально распространённые аллельные варианты, в том числе prn1, prn2 и prn3. Мировые исследования показали, что prn1 преобладал до 1996 г., когда начал появляться аллель prn2, что совпало с появлением БКВ [24]. В нашем исследовании аллель prn2 был выявлен в 94,1% проанализированных образцов, несмотря на то что в нашей стране используется как ЦКВ, так и БКВ. Аналогичные результаты были получены в других странах, где применяется ЦКВ, таких как Аргентина [16], Тунис [25]. Данные, полученные на моделях мышей, свидетельствуют о том, что штаммы, несущие prn2 в сочетании с ptxP3, демонстрируют более высокую колонизацию и приспособляемость, чем штаммы ptxP1/prn3, независимо от иммунного статуса хозяина [23].

Ген fim3 имеет 5 аллельных вариантов (fim3-1, fim3-2, fim3-3, fim3-5 и fim3-6), среди которых fim3-1 и fim3-2 являются преобладающими вариантами во всём мире [24, 26]. В соответствии с этими глобальными тенденциями наше исследование показало, что fim3-1 является преобладающим аллелем по сравнению с fim3-2 (82,7% против 16,5% соответственно). Это согласуется с геномными исследованиями, показывающими, что fim3-1 преобладал исторически, в то время как распространённость fim3-2, появившегося в период использования ЦКВ (частота ~ 1%), увеличилась до 37% в странах, применяющих пятикомпонентные БКВ [16, 25]. Различия в распространённости аллелей fim3, таких как fim3-2, в странах, где используются ЦКВ, могут быть связаны с передачей возбудителя между странами, генетическим расхождением с вакцинными штаммами, иммунным статусом населения, селективным давлением или адаптацией штаммов к иммунитету, вызванному вакциной [24, 25, 27]. Например, в Австралии и Великобритании, где в основном используются трёхкомпонентные БКВ, не содержащие Fim2 и Fim3, fim3-1 остаётся преобладающим аллелем [27, 28], в то время как появление fim3-2 связывают с переходом от ЦКВ к пятикомпонентным БКВ в конце 1980-х гг. [24]. Эти данные свидетельствуют о том, что селективное давление, оказываемое составом вакцины, может формировать генетическое разнообразие B. pertussis.

В ходе нашего исследования мы выявили 6 генотипов B. pertussis, циркулировавших в России с 2023 по 2025 г. с доминированием двух: ptxP3/fim3-1/prn2, который преобладал (75,9%), и ptxP3/fim3-2/prn2, который встречался реже (16,5%).

По данным наших предыдущих исследований динамики эпидемического процесса коклюшной инфекции, на территории России циркулировали штаммы 19 (генотипирование по ptxP-fim3-prn) генотипов: ptxP1/fim3-1/prn1, ptxP2/fim3-1/prn1, ptxP2/fim3-1/prn9, ptxP1/fim3-2/prn3, ptxP1/fim3-2/prn1, ptxP1/fim3-1/prn3, ptxP1/fim3-3/prn2, ptxP3/fim3-4/prn1, ptxP3/fim3-4/prn2, ptxP1/fim3-2/prn2, ptxP2/fim3-2/prn1, ptxP3/fim3-1/prn9, ptxP1/fim3-1/prn2, ptxP3/fim3-1/prn1, ptxP3/fim3-2/prn9, ptxP3/fim3-1/prn2, ptxP3/fim3-2/prn3, ptxP2/fim3-2/prn4 и ptxP3/fim3-2/prn2, большинство из которых зарегистрированы с конца 1990-х гг. [29].

Генотип ptxP3/fim3-1/prn2 отличается от ptxP3/fim3-2/prn2 одной точечной мутацией в fim3. Это изменение привело к клональной экспансии, которая совпала со снижением индекса разнообразия с 0,66 до 0,35 [30]. Всесторонний геномный анализ изолятов из Китая, Финляндии и Нидерландов выявил потерю с течением времени генов, в основном расположенных в белково-кодирующих последовательностях, связанных с репликацией, рекомбинацией, репарацией и транскрипцией. Анализ также выявил накопление более 100 SNP в штаммах, содержащих ptxP3, в основном расположенных в генах, связанных с транспортом и метаболизмом. Эти результаты могут объяснить успешное появление линии ptxP3/fim3-1/prn2 и её глобальное распространение [31].

Заключение

Прямое генотипирование клинических образцов с использованием nested-ПЦР продемонстрировало высокую информативность для выявления аллелей промотора коклюшного токсина ptxP (> 97%), однако для генов fim3 и prn доля успешно типированных образцов оставалась относительно низкой (31 и 28% соответственно), что, по-видимому, связано с низкой бактериальной нагрузкой в части проб и указывает на необходимость дальнейшей оптимизации методики. Несмотря на это, полученные данные свидетельствуют о полном вытеснении «исторических» аллелей ptxP1/ptxP2 вариантом ptxP3 и доминировании генотипа ptxP3/fim3-1/prn2 во всех обследованных регионах России. Подтверждённое единообразие циркулирующей популяции, находящейся под давлением как ЦКВ, так и БКВ, делает актуальным расширение панели типируемых мишеней и переход к полногеномному секвенированию клинических образцов, что позволит улавливать ранние сигналы адаптивной эволюции возбудителя, невидимые при анализе ограниченного числа генов.

 

¹ URL: https://www.megasoftware.net/

² URL: https://bigsdb.pasteur.fr/

About the authors

Irina Yu. Andrievskaya

G.N. Gabrichevsky Research Institute of Epidemiology and Microbiology

Author for correspondence.
Email: andrievskaya.iri@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-2997-942X

Cand. Sci. (Biol.), researcher, Diphtheria, pertussis аnd tetenus research center

Russian Federation, Moscow

Olga Yu. Borisova

G.N. Gabrichevsky Research Institute of Epidemiology and Microbiology

Email: olgborisova@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-6316-5046

Dr. Sci. (Med.), Professor, Director

Russian Federation, Moscow

Alena S. Pimenova

G.N. Gabrichevsky Research Institute of Epidemiology and Microbiology

Email: alenaa_85@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-6914-3531

Cand. Sci. (Med.), leading researcher, Diphtheria, pertussis аnd tetenus research center

Russian Federation, Moscow

Maria A. Leonova

G.N. Gabrichevsky Research Institute of Epidemiology and Microbiology

Email: vardanka00@yandex.ru
ORCID iD: 0009-0006-4376-1119

junior researcher, Diphtheria, pertussis аnd tetenus research center

Russian Federation, Moscow

References

Supplementary files