Attenuated omicron-like SARS-CoV-2 strain

Full Text

Введение

В последние десятилетия мир столкнулся с такими угрозами, как риск глобального распространения коронавирусов SARS-CoV (2003) и MERS-CoV (с 2012 г. по настоящее время) и пережил пандемию COVID-19 (2020-2023), вызванную коронавирусом SARS-CoV-2. От COVID-19 и его последствий погибло более 7 млн. человек во всем мире, что свидетельствует о недостаточной готовности национальных систем здравоохранения к появлению пандемических штаммов вирусов. Несмотря на сформировавшийся высокий уровень популяционного иммунитета против новой коронавирусной инфекции, сохраняется риск появления новых эпидемически значимых вариантов SARS-CoV-2, способных привести к подъему заболеваемости COVID-19. Появление и широкое распространение варианта Omicron и его сублиний снизило эффективность вакцинопрофилактики COVID-19. В результате эволюции SARS-CoV-2 появились мутанты вируса, ускользающие от естественного и поствакцинального иммунитета, что привело к быстрому снижению эффективности лицензированных вакцин [1, 2]. В то же время, сохраняется вероятность передачи от животных человеку других коронавирусов и возникновения новых эпидемий. В связи с этим, проблема разработки средств специфической профилактики COVID-19 и других коронавирусных заболеваний остается актуальной. Возможным решением данной проблемы могла бы стать разработка живой аттенуированной вакцины, способной вызывать стойкий иммунный ответ как к структурным, так и неструктурным вирусным белкам и активировать не только гуморальное, но и клеточное звено иммунитета [3–5]. Применение живых вирусных вакцин обосновано не только их высокой иммунологической эффективностью, но и экономической целесообразностью, поскольку они отличаются низкой себестоимостью производства.

Ранее в ФГБНУ НИИВС им. И.И. Мечникова от пациентов с лабораторно подтвержденным COVID-19 в культуре клеток почки обезьяны Vero CCL-81 в разные периоды пандемии получены штаммы SARS-CoV-2 Dubrovka (Ухань-подобный) и FEB2 (Omicron BA.5.2). Видовая и субвидовая таксономическая принадлежность штаммов была установлена методом ОТ-ПЦР-РВ и подтверждена путем полногеномного секвенирования с последующим филогенетическим анализом. Путём длительного пассирования Ухань-подобного штамма Dubrovka в клетках почки обезьян Vero CCL-81 при температуре, постепенно понижаемой до 23ºC, получен холодоадаптированный (са) мутант D-D2, проявляющий температурочувствительный (ts) фенотип в культуре клеток и аттенуационный (att) фенотип для золотистых сирийских хомячков (далее – хомячки) [6]. При однократной интраназальной иммунизации хомячков штамм D-D2 вызывал сероконверсию у всех иммунизированных животных и обеспечивал высокоэффективную защиту хомячков от развития продуктивной инфекции и пневмонии при заражении как родительским штаммом Dubrovka, так и гетерологичными штаммами, относящимися к вариантам Delta (AY.122) и Omicron (сублинии BA.1.1 и BA.5.2) [7]. Вместе с тем, ts мутант D-D2 сохранил остаточную вирулентность для хомячков, проявляющуюся в ограниченной репродукции вируса в легких и слабовыраженной очаговой интерстициальной пневмонии, что не позволяет охарактеризовать его как полностью безопасный. Остаточная вирулентность мутанта D-D2 определяется, вероятно, тем, что он утратил способность к размножению при температуре 39°С, но при этом размножался при 37°С, сохранив таким образом способность заражать легкие [6]. В связи с этим, нам представилось целесообразным получить ts мутант омикрон-подобного штамма SARS-CoV-2 FEB2, относящегося к сублинии BA.5.2, и исследовать его вирулентность и иммуногенность для чувствительных животных. Выбор для аттенуации штамма FEB2 определяется тем, что он характеризуется более низкой вирулентностью по сравнению с Ухань-подобным штаммом Dubrovka [8], а также схожестью антигенных свойств по отношению к актуальным циркулирующим штаммам SARS-CoV-2.

Материалы и методы

Вирус. В исследовании использованы лабораторный штамм SARS-CoV-2 FEB2 (Omicron BA.5.2, GenBank ID OP920753.1), изолированный от пациента с СOVID-19 в октябре 2022 г., и его ts мутанты F-F1, F-F3, F-D3, F-D12, F-C5 и F-C9 (GenBank ID   PX401966-PX401971), а также Ухань-подобный штамм SARS-CoV-2 Dubrovka (GenBank ID MW514307.1).

Культивирование клеток и вируса. SARS-CoV-2 культивировали на клетках эпителия почек африканской зеленой мартышки Vero CCL-81 (ATCC), как описано ранее [9]. Монослой клеток Vero CCL-81 инфицировали SARS-CoV-2 при низкой множественности заражения (MOI≤0,001) и инкубировали при температуре 37°C (штамм FEB2) или 24°C (са мутанты штамма FEB2) в течение 3-10 дней в атмосфере 5% CO₂ до появления выраженного цитопатического действия (ЦПД). Вируссодержащую культуральную среду осветляли центрифугированием, титровали и хранили при температуре минус 80°C до использования.

Титрование вируса. Титр SARS-CoV-2 определяли по конечной точке проявления ЦПД в культуре клеток Vero CCL-81 как описано ранее [9]. Штаммы FEB2 и Dubrovka титровали при температуре 37°C, са мутанты штамма FEB2 - при 30°C. Титр вируса рассчитывали методом Ramakrishnan M.A. [10] и выражали в lg ТЦД₅₀/мл.

Оценка ts фенотипа са мутантов SARS-CoV-2. Клетки Vero заражали родительским штаммом FEB2 и ca мутантами при MOI 0,001 и инкубировали при температурах 37°С и 39°С в течение 4 суток в атмосфере 5% СО₂. В конце инкубации отбирали образец культуральной жидкости и хранили определяли титр вируса и концентрацию вирусной РНК. Разница в титре вируса или концентрации вирусной РНК по сравнению с заражением штаммом FEB2 на 4,0 lg и более свидетельствовала о наличии у ca мутанта ts фенотипа.

Количественное определение РНК SARS-CoV-2. Количественное определение РНК SARS-CoV-2 проводили методом ОТ-ПЦР-РВ как описано ранее [11]. Вирусную РНК выделяли из образцов с использованием набора реагентов «MagnoPrime UNI» («NextBio», Россия). Для обнаружения вирусной РНК использовали праймеры и зонд, направленные к гену нуклеокапсида N SARS-CoV-2: CoVN-F GCGTTCTTCGGAATGTCG, COVN-R TTGGATCTTTGTCATCCAATTTG, COVN-P FAM-AACGTGGTTGACCTACACAGGT-BHQ1 [12].

Секвенирование генома SARS-CoV-2. Нанопоровое секвенирование генома SARS-CoV-2 проводили в секвенаторе MinION в проточной ячейке Flow Cell R9.4 с использованием программного обеспечения «MinKNOW» и наборов реагентов производства «Oxford Nanopore Technologies» (Великобритания) как описано ранее [6]. Сборку генома осуществляли в программе «Minimap2 v. 2.24».

Определение антител к SARS-CoV-2. Антитела к SARS-CoV-2 в сыворотках крови хомячков определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА), как описано ранее [11]. Для постановки ИФА в 96-луночные планшеты сорбировали препарат SARS-CoV-2 (штамм Dubrovka), инактивированного УФ-излучением как описано ранее. Титр нейтрализующих антител определяли в культуре клеток Vero CCL-81 как описано ранее [9].

Просвечивающая электронная микроскопия. Осветленную центрифугированием (4000 об/мин в течение 10 мин при 4°C) вируссодержащую культуральную жидкость с известным титром инактивировали в чашке Петри под штатной бактерицидной ультрафиолетовой лампой бокса микробиологической безопасности (λ = 253,7 нм) в течение 6 мин с периодическим покачиванием. Вирус концентрировали пропусканием через фильтры Amicon Ultra 100 (Merck) в течение 10 мин при 4500 об/мин и ресуспендировали в 1 мл стерильного ФСБ (рН 7,2). Аликвоты вируса хранили при -80ºС до микроскопического исследования. Для получения иммунных комплексов к исследуемому образцу вируса в объеме 50 мкл добавляли 3 мкл сыворотки кроликов, гипериммунизированных штаммом FEB2, перемешивали, инкубировали 1 ч при 37°С и наносили на сетку. Для негативного контрастирования 7 мкл образца наносили на медную сетку, покрытую формваром с углеродным напылением (TedPella, США), выдерживали в течение 1 минуты; избыток жидкости оттягивали фильтровальной бумагой. Далее наносили 7 мкл 2% водного раствора фосфорно-вольфрамовой кислоты (ФВК; рН = 7,0), выдерживали в течение 30 секунд, избыток раствора удаляли. ТЭМ проводили на микроскопе JEM-2100 (JEOL, Япония).

Животные. Четырёхнедельные самки золотистых сирийских хомячков (Mesocricetus auratus) массой 40–50 г были получены из питомника лабораторных животных Филиала ИБХ РАН в г. Пущино (Московская обл.). Животных заражали вирусом SARS-CoV-2 интраназально под лёгким эфирным наркозом в объеме 100 мкл на обе ноздри. За животными велось ежедневное наблюдение в течение всего срока проведения эксперимента. Животные содержались в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей [13] и правилами по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев) (ГОСТ 33215-2014). Все процедуры, проводимые с животными, были одобрены Локальным этическим комитетом ФГБНУ НИИВС им. И.И. Мечникова до начала исследований (Протокол №2 от 24.05.2021 г.). При проведении экспериментального исследования на животных авторы соблюдали институциональные и национальные стандарты по использованию лабораторных животных.

Оценка вирулентности SARS-CoV-2. Хомячки были случайным образом распределены по трем группам (n=6). Животных 1 и 2 групп заражали интраназально штаммами FEB2 и F-F3, соответственно, в дозе 5,0 lg ТЦД₅₀/животное. Хомячкам 3 группы (К-) интраназально вводили ФСБ. Ежедневно оценивали состояние животных и проводили контроль веса. Через 4 суток после заражения животных гуманно умерщвляли, легкие, носовые ходы и мозг извлекали, гомогенизировали в среде DMEM с гентамицином (40 мкг/мл) с использованием гомогенизатора Tissue Lyser LT (Qiagen), осветляли центрифугированием (4000 об/мин в течение 10 мин при 4°C) и хранили при температуре минус 80°С до исследования. В осветленных гомогенатах органов определяли титр вируса и концентрацию вирусной РНК. Достоверно более низкие значения титра вируса и концентрации РНК мутантного штамма в легких и носовых ходах по сравнению с заражением диким штаммом свидетельствовало о наличии у вируса att фенотипа.

Требования к безопасности работ. Все работы с вирусом SARS-CoV-2 проводили в условиях, отвечающих требованиям безопасности работ с ПБА II группы патогенности.

Статистический анализ. Статистическая обработка проводилась с использованием программного обеспечения GraphPad Prism v.5.03. Данные на графиках представлены в виде среднего ± стандартное отклонение (SD) или ± стандартная ошибка (SE). Для сравнения показателей использован U-критерий Манна-Уитни. Различия считались значимыми при p < 0,05.

Результаты

Для получения ts мутантов был выбран омикрон-подобный штамм SARS-CoV-2 FEB2, обладающий высокой репродуктивной активностью в культуре клеток Vero CCL-81. В результате проведения 24-х пассажей штамма FEB2 в клетках Vero CCL-81 при постепенно понижаемой температуре (пассажи 1-4 - 37ºC, пассаж 5 - 35ºC, далее снижение температуры на 1ºC на каждом пассажном уровне) получен его са мутант (FEB2_ca), способный размножаться при температуре 24ºC. На основе FEB2_ca путем трехкратного клонирования методом предельных разведений было получено 6 клонов вируса (F-F1, F-F3, F-D3, F-D12, F-C5 и F-C9), способных к размножению при температуре 24ºC (рис. 1А). Клоны-мутанты F-F1, F-F3, F-D3, F-D12 обладали выраженным ts фенотипом, то есть утратили способность размножаться при температуре 37ºC и 39ºC (рис. 1Б, 1В).

 

Рисунок 1. Выявление ts фенотипа разных вариантов штамма FEB2 в культуре клеток Vero CCL-81. Концентрация вирусной РНК: А - через 9 суток после инфицирования (п.и.) при температуре 24ºC; Б – через 4 суток п.и. при температуре 37ºC; В - через 4 суток п.и.  при температуре 39ºC. Представлены средние значения двух независимых экспериментов. Отрезки показывают разницу между двумя значениями.

Figure 1. Identification of ts phenotype of different variants of the FEB2 strain in cell culture Vero CCL-81. Viral RNA concentration: A – 9 day post infection, 24°C; B – 4 day post infection, 37°C; C – 4 day post infection, 39°C. Mean values from two independent experiments. Bars show difference between two meanings.

Электронно-микроскопическое исследование препаратов родительского штамма FEB2 и клона-мутанта F-F3 не выявило различий в морфологии вирусных частиц между вариантами вируса (рис. 2А, В). Популяция вируса включала сферические или овальные частицы с диаметром от 90 до 150 нм, окруженные по контуру «шипами» S-белка. И родительский штамм, и ts мутант после инкубации с иммунной сывороткой кролика, гипериммунизированного штаммом FEB2, образовывали иммунные комплексы (рис. 2Б, Г), содержащие от двух до нескольких десятков вирионов.

 

 

Рисунок 2. Просвечивающая электронная микроскопия негативно контрастированных вирионов штаммов (A) FEB2 и (В) F-F3 и иммунных комплексов, полученных при инкубации с иммунной сывороткой вирионов штаммов (Б) FEB2 и (Г) F-F3. Масштабный отрезок - 200 нм.

Figure 2. Transmission electron microscopy of negatively contrasted virions of (A) FEB2 and (C) F-F3 strains and immune complexes obtained by incubation with immune serum of (B) FEB2 and (D) F-F3 strains. The scale bar is 200 nm.

В результате полногеномного секвенирования в геномах клонов-мутантов F-F1, F-F3, F-D3, F-D12, F-C5 и F-C9 (GenBank ID   PX401966-PX401971) обнаружено от 21 до 24 нуклеотидных замен, преимущественно несинонимичных. Из числа полученных ts мутантов для оценки вирулентности для хомячков выбран клон F-F3 (далее – штамм F-F3), чувствительный к температуре 37ºC и выше. Сравнительный анализ геномов штамма F-F3 (GenBank ID   PX401966) и его родительского штамма FEB2 GenBank ID (OP920753.1) показал, что в результате адаптации к росту в культуре клеток Vero CCL-81 при температуре 24°С он приобрел 23 нуклеотидные замены (C3154T, C10175T, C10801T, C11422T, C13132T, T15353C, G17535A, G17915T, C19515T, C19863T, T22772G, G23754T, A24339T, C24348A, C24349G, G26316A, G26488A, C26501T, A26668G, G28507T, C28626A, C29070A, C29312T), из которых 20 приводили к аминокислотным заменам в белках NSP3 (P971L), NSP5 (T3520I, A3727V), NSP6 (T4297I), NSP12 (S5038P), NSP13 (C5765Y, G5892C), NSP14 (S6425L, A6541V), S (N414K, D742Y, T937S, P940S), E (R38Q), M (D3N, T7I, T63A), N (R95L, P132T, Q280K).   

Интраназальная иммунизация хомячков штаммом F-F3 в дозе 5,0 lg ТЦД₅₀/животное не вызывала у них патологических изменений в легких, задержки прироста массы тела и изменений в поведении. Репродукция штамма F-F3 на 4-й день п.и. была обнаружена только в носовых ходах, тогда как в гомогенатах легких и мозга инфекционная активность вируса не была выявлена (рис. 3А), что хорошо согласовалось с содержанием в этих органах вирусной РНК (рис. 3Б). Титр вируса в носовых ходах хомячков на 4-й день п.и. был на 1,3 lg ТЦД₅₀/мл, а концентрация вирусной РНК на 1,6 lg копий РНК/мл ниже, чем при заражении диким вирусом в аналогичной дозе (p<0,01).

 

Рисунок 3. Вирусная нагрузка в органах хомячков на 4-й день после инфицирования штаммами FEB2 и F-F3. А – титр вируса, Б – концентрация вирусной РНК, средние значения ± SE, ** - р<0,01.

Figure 3. Virus load in hamster organs on 4 day post challenge with FEB2 and F-F3 strains. A – virus titer, B – concentration of viral RNA. Mean values ± SE, ** - р<0,01.

 

Для оценки иммуногенности штамма F-F3 хомячков интраназально иммунизировали штаммами F-F3 (n=12) в дозе 5,0 lg ТЦД₅₀/животное. Контрольную группу животных заражали штаммом FEB2 (n=6) в аналогичной дозе. В качестве отрицательного контроля выступали неиммунизированные животные (n=6). Через 21 день после иммунизации у всех иммунизированных животных методом ИФА выявлена сероконверсия, при этом титр IgG к SARS-CoV-2 при иммунизации F-F3 был в среднем в 3,5 раза ниже (3050±2702), чем при иммунизации родительским штаммом FEB2 (10667±3350) (p<0,05). В сыворотках всех иммунизированных F-F3 хомячков обнаружены вируснейтрализующие антитела к штамму FEB2 в титре от 80 до 640 (в среднем - 333±207). В сыворотках неиммунизированных животных антитела к вирусу обнаружены не были.

Следующий этап заключался в оценке стабильности ts фенотипа штамма F-F3. Для этого адаптированный к температуре 24°С штамм F-F3 на протяжении 6 пассажей выращивали в культуре клеток Vero CCL-81 при температурах 33°С и 37°С. При температуре 37°С инфекция F-F3 носила абортивный характер (вирус не размножался, не вызывал ЦПД, проявляя ts фенотип). При температуре 33°С на всех пассажных уровнях F-F3 размножался, вызывая выраженное ЦПД, что сопровождалось накоплением в культуральной жидкости вирусной РНК на уровне 8,0 lg копий РНК/мл и выше. Вирусное потомство, полученное после проведения 6 пассажей при температуре 33°С (вариант F-F3-33), проверяли на чувствительность к температурам 37°С и 39°С (табл. 1). Если при температуре 33°С родительский штамм FEB2 и вариант F-F3-33 размножались в клетках Vero CCL-81 с одинаковой эффективностью, то при температуре 37°С и 39°С к размножению был способен только штамм FEB-2, о чем свидетельствует прирост концентрации вирусной РНК и развитие ЦПД. Отсутствие признаков репродукции варианта F-F3-33 при температурах 37°С и 39°С свидетельствует о стабильности ts фенотипа штамма F-F3 в условиях культивирования при температуре 33°С.

 

Таблица 1. Оценка чувствительности варианта F-F3-33 к температуре 37°С и 39°С в культуре клеток Vero CCL-81 (MИ=0,001)

Table 1. Assessment of sensitivity to temperature 37°C and 39°C of F-F3-33 in cell culture Vero CCL-81 (MOI=0,001)

Температура культивирования	Вирус	Концентрация вирусной РНК на разные сроки п.и., lg копий РНК/мл				ЦПД на 4-е сутки
		1 сутки	2 сутки	3 сутки	4 сутки
33°С	F-F3-33	5,2	8,4	9,0	8,7	Есть
	FEB2	4,0	7,9	9,5	8,2	Есть
37°С	F-F3-33	≤3,0	≤3,0	≤3,0	≤3,0	Нет
	FEB2	4,5	8,3	9,7	10,0	Есть
39°С	F-F3-33	≤3,0	≤3,0	≤3,0	≤3,0	Нет
	FEB2	4,1	8,4	9,8	9,5	Есть

 

Важной характеристикой, определяющей безопасность вакцинного штамма, является его способность передаваться от иммунизированных лиц восприимчивым неиммунным. В связи с этим, нам представилось целесообразным оценить контагиозность штамма F-F3. С этой целью, к группе хомячков (n=6), иммунизированных интраназально штаммом F-F3 в дозе 5,0 lg ТЦД₅₀/мл, сразу после иммунизации были подсажены три неиммунных хомячка, которые содержались вместе с иммунизированными животными на протяжении всего эксперимента. Через 21 день п.и. у «подсаженных» хомячков антитела к SARS-CoV-2 обнаружены не были. Отсутствие сероконверсии свидетельствует о том, что штамм F-F3 подсаженным животным не передался, несмотря на тесный контакт с иммунизированными животными. Через 28 дней п.и. иммунизированные хомячки были заражены вирулентным штаммом SARS-CoV-2 Dubrovka в дозе 4,0 lg ТЦД₅₀/мл, и через 21 день после заражения в сыворотках крови всех трех «подсаженных» хомячков выявлены антитела к SARS-CoV-2 (средний титр антител 17067±4267). Выявленную сероконверсию можно трактовать как результат заражения «подсаженных» хомячков вирулентным штаммом Dubrovka, что подтверждалось тем, что вируснейтрализующая активность выявленных антител по отношению к Ухань-подобному штамму Dubrovka (853±213) была в среднем в 10 раз меньше, чем по отношению к омикрон-подобному штамму FEB2 (87±41) (р <0,05).

Обсуждение

Одним из традиционных подходов к созданию живых вакцин, доказавших свою эффективность, является холодовая адаптация вируса с получением ts мутантов. Основанные на ts мутантах сезонные живые гриппозные вакцины, принципы создания которых сформулированы более 50 лет назад [14, 15], сочетают перекрестную протективную активность, простоту интраназального введения, формирование мукозального иммунитета во входных воротах инфекции. Вирус, адаптированный к росту в культуре клеток при пониженной температуре, утрачивает способность к размножению при физиологической температуре 37°C и выше (ts фенотип). Следовательно, ts мутант не способен поражать легкие и другие внутренние органы и вызывать в них патологические изменения. Такая избирательность ts мутанта определяется тем, что температура в легких и в других жизненно важных внутренних органах условно здорового человека превышает 37°C, а в головном мозге составляет в среднем 38,5°C [16]. В научной литературе описано получение аттенуированных ts штаммов SARS-CoV-2, полученных на основе вариантов вируса, которые прекратили свою циркуляцию еще в 2021-2022 гг. [17, 18], до появления варианта Omicron, ставшего причиной самого масштабного подъема заболеваемости [19].

В настоящем исследовании возможность аттенуации SARS-CoV-2 путем холодовой адаптации, первоначально продемонстрированная нами на Ухань-подобном штамме Dubrovka [6], была подтверждена с использованием более актуального, омикрон-подобного штамма FEB2 (сублиния BA.5.2). В результате адаптации штамма FEB2 к росту в культуре клеток Vero CCL-81 при температуре 24°С ряд клонов-мутантов приобрели ts фенотип, утратив способность размножаться в культуре клеток при температуре 37°С. При выборе штамма SARS-CoV-2 для получения ts мутанта мы руководствовались тем, что он должен обладать схожими антигенными свойствами по отношению к актуальным диким штаммам, и при этом изначально характеризоваться пониженной вирулентностью. В наибольшей степени этим требованиям отвечал омикрон-подобный штамм FEB2, способный вызывать у хомячков пневмонию, не поражая головной мозг [8].

Выбранный нами для дальнейшего исследования ts штамм F-F3 при интраназальном заражении хомячков, в отличие от родительского штамма, не поражал легкие, но сохранял жизнеспособность в носовых ходах, но интенсивность вирусной репродукции в носовых ходах была ниже, чем у родительского штамма. Способность к заражению верхних отделов респираторного тракта определило иммуногенность F-F3.

Штамм F-F3 в присутствии иммунной сыворотки формировал иммунные комплексы, что указывает на сохранение у поверхностных белков (в первую очередь S-белка) ts мутанта, выращенного при не физиологичной температуре 24°C, антигенных свойств, несмотря на четыре аминокислотные замены в S-белке - N414K, D742Y, T937S, P940S. Такой вывод подтверждается способностью штамма F-F3 при интраназальной иммунизации вызывать у всех иммунизированных золотистых сирийских хомячков сероконверсию с выработкой вируснейтрализующих антител. Сероконверсия проявилась у всех иммунизированных штаммом F-F3 животных, при этом титр антител был значительно ниже, чем при иммунизации соответствующей дозой дикого вируса. Более низкую иммуногенность F-F3 по сравнению с родительским вирусом, характерную для вакцинных штаммов, можно рассматривать как дополнительный маркер аттенуации вируса.

Одной из ключевых характеристик, определяющих безопасность клинического применения живых аттенуированных вакцин, является стабильность att фенотипа вакцинного штамма, что минимизирует вероятность реверсии вирулентности. Проблема нестабильности att фенотипа вакцинных штаммов проявилась, например, в появлении циркулирующих вакцинородственных полиовирусов - ревертантов вакцинных штаммов оральной полиомиелитной вакцины. Вирулентность вакцинородственных полиовирусов может быть сопоставимой с вирулентностью диких штаммов полиовируса, поэтому в странах, избавившихся от циркуляции диких штаммов, переходят от применения оральной полиомиелитной вакцины к инактивированной [20]. Кроме того, He D.C. с соавт. обнаружили в 2021 циркуляцию среди населения в Индии рекомбинантных штаммов SARS-CoV-2, появившихся, предположительно, в результате клинических испытаний живой аттенуированной вакцины, и описали связанные с этим риски [22]. Важной характеристикой штамма F-F3 является стабильность его ts фенотипа при культивировании при температуре 33°С. При моделировании in vitro условий для культивирования ts мутанта, при которых могла бы произойти реверсия, мы выбрали пермиссивную для вируса температуру 33°С, что примерно соответствует условиям верхних отделов дыхательных путей. Поскольку именно ts фенотип определяет аттенуацию вируса, полученные результаты указывают и на стабильность att фенотипа штамма F-F3.

Иммунизированные штаммом F-F3 хомячки не заражали подсаженных в ту же клетку неиммунных хомячков, несмотря на тесный контакт между ними, что свидетельствует о низкой контагиозности F-F3. Те же неиммунные хомячки при заражении находящихся с ними в одной клетке иммунизированных хомячков вирулентным штаммом SARS-CoV-2 Dubrovka заразились от них. С одной стороны, это свидетельствует об их восприимчивости к SARS-CoV-2-инфекции, а с другой - выявило высокую контагиозность неаттенуированного штамма Dubrovka. Если рассматривать штамм F-F3 в качестве кандидатного вакцинного штамма, то его низкая контагиозность снижает вероятность циркуляции вакцинного штамма среди населения в условиях массовой вакцинации и риски появления вирулентных вакцинородственных штаммов или рекомбинантов вакцинного и дикого вируса.

Полученные нами результаты о стабильности ts фенотипа в условиях in vitro и низкой контагиозности штамма F-F3 требуют подтверждения в дополнительных исследованиях на чувствительных животных.

Заключение

Получен непатогенный для золотистых сирийских хомячков омикрон-подобный ts мутант SARS-CoV-2 - штамм F-F3. Будучи чувствительным к температуре 37°С и выше, штамм F-F3 утратил способность заражать легкие хомячков, но сохранил способность заражать носовые ходы, благодаря чему сохранил иммуногенность. В условиях длительного культивирования при температуре 33°С штамм F-F3 проявил стабильность ts фенотипа, что свидетельствует о низком риске реверсии вирулентности в условиях клинического применения. Совокупность выявленных характеристик аттенуированного штамма F-F3 свидетельствует о целесообразности дальнейшего исследования его безопасности и протективной активности на животной модели COVID-19. Штамм F-F3 также представляет интерес для получения на его основе «донора аттенуации», позволяющего создавать методами обратной генетики вакцинные штаммы, сочетающие аттенуационный фенотип ts штамма F-F3 и антигенные свойства циркулирующих штаммов SARS-CoV-2.

Источник финансирования

Исследование выполнено при финансовом обеспечении Министерства науки и высшего образования РФ (тема НИР FGFS-2024-0009). Электронно-микроскопическое исследование вирусных препаратов выполнено в рамках государственного задания МГУ имени М.В. Ломоносова.

Участие авторов  

Е.Б. Файзулоев, А.В. Грачева, Е.Р. Корчевая – дизайн исследования, выполнение экспериментальной части, написание статьи; Д.М. Хохлова, А.С. Масленникова – выполнение экспериментальной части; Т.С. Трифонова, Л.В. Кордюкова, А.В. Моисеенко – электронно-микроскопическое исследование вирусных препаратов; О.А. Свитич, В.В. Зверев – концепция, редактирование статьи. Все авторы внесли значимый вклад в проведение исследования, подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией.

Конфликт интересов

Авторы данной статьи подтвердили отсутствие конфликта интересов, о котором необходимо сообщить.

About the authors

Evgeny B. Faizuloev

I.I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera; Russian Medical Academy of Continuous Professional Education

Author for correspondence.
Email: faizuloev@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-7385-5083

PhD (Biol.), Head of Laboratory of applied virology; Senior lecturer, Department of Virology

Russian Federation, 105064, Russia, Moscow, Maly Kazenny pereulok, 5a; 125993, Russia, Moscow, 2/1 Barrikadnaya Street, building 1

Anastasiia V. Gracheva

I.I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: anastasiia.gracheva.95@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-8428-4482

researcher of Laboratory applied virology, Department of Virology

Russian Federation, 105064, Russia, Moscow, Maly Kazenny pereulok, 5a

Ekaterina R. Korchevaya

I.I. Mechnikov Research Institute for Vaccines and Sera

Email: c.korchevaya@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-6417-3301

junior researcher, Laboratory of applied virology, Department of Virology

Russian Federation, 105064, Russia, Moscow, Maly Kazenny pereulok, 5a

Darya M. Khokhlova

I.I. Mechnikov Research Institute for Vaccines and Sera

Email: dasharose1995@mail.ru
ORCID iD: 0009-0003-5745-7589

junior researcher, Laboratory of applied virology, Department of Virology

Russian Federation, 105064, Russia, Moscow, Maly Kazenny pereulok, 5a

Asya S Maslennikova

I.I. Mechnikov Research Institute for Vaccines and Sera

Email: asya.masletso@mail.ru
ORCID iD: 0009-0008-5123-4946

junior researcher, Laboratory of applied virology, Department of Virology

105064, Russia, Moscow, Maly Kazenny pereulok, 5a

Tatiana S. Trifonova

Lomonosov Moscow State University

Email: trf.trifonova@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-2042-5244

laboratory assistant of Department of Bioengineering, Faculty of Biology

Russian Federation, 119991, Russia, Moscow, GSP-1, 1-12 Leninskie Gory

Larisa V. Kordyukova

A. N. Belozersky Research Institute
of Physico-Chemical Biology MSU

Email: kord@belozersky.msu.ru
ORCID iD: 0000-0002-6089-1103

D. Sci. (Biol.), Leading Researcher of Department of Chromatographical Analysis

Russian Federation, 119992, Russia, Moscow, Leninskye gory, house 1, building 40

Andrey V. Moiseenko

Lomonosov Moscow State University

Email: postmoiseenko@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-1112-2356

researcher of Department of Bioengineering, Faculty of Biology

Russian Federation, 119991, Russia, Moscow, GSP-1, 1-12 Leninskie Gory

Oksana A. Svitich

I.I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera; I.M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)

Email: svitichoa@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-1757-8389

D. Sci. (Med.), Academician of the RAS, Head, Immunology and Allergology department, Director

Russian Federation, 105064, Russia, Moscow, Maly Kazenny pereulok, 5a; 119048, Russia, Moscow, 8 Trubetskaya St., building 2

Vitaly V. Zverev

I.I. Mechnikov Research Institute for Vaccines and Sera; I.M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)

Email: vitalyzverev@outlook.com
ORCID iD: 0000-0001-5808-2246

D. Sci. (Biol.), Prof., Academician of RAS, Scientific Adviser, Head, Department of microbiology, virology and immunology

Russian Federation, 105064, Russia, Moscow, Maly Kazenny pereulok, 5a; 119048, Russia, Moscow, 8 Trubetskaya St., building 2

References

Supplementary files