EFFECT OF OSMOTIC AND OXIDATIVE STRESS ON STRAINS OF GENOVARIANTS OF VIBRIO CHOLERAE EL TOR BIOVAR

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Возбудитель холеры - Vibrio cholerae вызывает тяжелое инфекционное заболевание человека с диарейным синдромом, способное к эпидемическому распространению. Всего в истории человечества зарегистрировано семь пандемий. Первые шесть предположительно были вызваны холерными вибрионами О1 серогруппы классического биовара, текущая, седьмая - токсигенными штаммами V. cholerae О1 серогруппы биовара Эль Тор, которые отличаются от классических вибрионов по структуре ряда генов вирулентности и регуляции их экспрессии. Среди структурных отличий необходимо отметить различия в нуклеотидных последовательностях гена-антирепрессора rstR и гена ctxB из оперона ctxAB, участвующих в биосинтезе холерного токсина (ХТ) и входящих в состав профага вирулентности СТСф. Эль Тор вибрионы содержат rstREltor и ctxBEltor (или ctxB3), а классические вибрионы - rstRClass и ctxBClass (или ctxB1) [19, 25]. Отличия в нуклеотидной последовательности гена ctxB отражаются на аминокислотной последовательности синтезируемого белка, в результате классические вибрионы продуцируют ХТ I (классического) типа, а Эль Тор вибрионы - II типа. Дальнейшие микроэволюционные преобразования Эль Тор вибрионов и приобретение ими в результате горизонтального переноса ряда генов классических вибрионов привели к появлению в 1990-х годах в эндемичных по холере регионах генетически измененных штаммов, или геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор с повышенной вирулентностью [18]. Геноварианты, в отличие от типичных Эль Тор вибрионов, вызвавших начало текущей пандемии, содержат аллель ctxB1 и являются более токсигенными, синтезируя повышенное количество холерного токсина классического типа [3, 13]. Начиная с 1993 года, геноварианты завозятся и на территорию России, вызывая вспышки и единичные случаи заболевания [6, 8, 9]. Необходимо отметить, что в период между эпидемиями холерный вибрион обитает в воде открытых водоемов как с пресной, так и с морской водой. В результате экологического анализа штаммов V. cholerae классического и Эль Тор биоваров было установлено, что Эль Тор вибрионы лучше приспособлены к выживанию во внешней среде, что и явилось одной из причин их быстрого распространения в мире [1, 4, 15]. В то же время, механизмы устойчивости недавно появившихся штаммов геновариантов к действию неблагоприятных факторов во внешней среде изучены не достаточно. Показано, что геноварианты, как и типичные штаммы, подвижны, способны формировать биопленку и длительное время выживать при недостатке питательных веществ, но в отличие от последних лучше адаптируются к изменению температуры [2, 20]. Более детальное исследование процессов выживаемости штаммов геновариантов после действия различных неблагоприятных факторов внешней среды позволит выявить причины их селективного преимущества в современный период. В связи с вышеизложенным, цель нашей работы заключалась в исследовании влияния осмотического и оксидативного стресса на выживаемость и изменение фенотипических и генетических свойств штаммов геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Исследования были проведены на 22 штаммах V. cholerae биовара Эль Тор, хранящихся в Государственной коллекции патогенных бактерий РосНИПЧИ «Микроб» в лиофиль-но высушенном состоянии. Для культивирования штаммов использовали LB агар и бульон (рН 7,2). Устойчивость культур к осмотическому (3 моль раствор NaCl) и оксидативному (20 ммоль перекись водорода) стрессу определяли по описанной ранее методике [23]. Для установления гемолитической активности и подвижности исследуемые штаммы V. cholerae выращивали в течение ночи при температуре 37°C в LB бульоне (рН 7,2). Получали изолированные колонии, которые затем с помощью реплики наносили на чашки с 1% LB агаром (рН 7,2) с добавлением 1% взвеси эритроцитов барана при изучении гемолитической активности или на полужидкий (0,6%) LB агар (рН 7,2) при установлении подвижности. Через 18 - 24 ч учитывали в мм зону лизиса эритроцитов вокруг макроколонии при наличии гемолитической активности или зону распространения колонии у подвижных штаммов (или отсутствие таковой у неподвижных) при определении подвижности. Продукцию растворимой гемагглютинин/протеазы определяли путем посева штаммов на агар LB, содержащий 10% обезжиренного молока [10]. Результат оценивали через 24 ч, измеряя зону просветления вокруг макроколонии. Продукцию фосфолипазы определяли, выращивая штаммы на среде LB с добавлением 2% эмульсии яичного желтка [21]. Через 48 ч инкубации при температуре 37°С учитывали зону просветления субстрата вокруг макроколоний. Для исследования бактерий атомно-силовой микроскопией (АСМ) фиксацию и обеззараживание материала проводили в соответствии с [5]. Работу проводили на сканирующем зондовом микроскопе «Solver P47-PRO» (NT-MDT, Россия) с использованием кремниевых кантилеверов NSG01 (NT-MDT, Россия), напыленных золотом для полуконтактной АСМ (резонансная частота кантилевера составляла 120 кГц, константа жесткости - 5,5 Н/м). Выделение ДНК из штаммов для постановки полимеразной цепной реакции осуществляли с использованием коммерческих наборов в присутствии 6 моль гуанидинтиоцианата. ПЦР проводили на программируемом термостате «Терцик» (ДНК-Технология, Москва) со специфическими праймерами, описанными ранее [7]. Продукты ПЦР анализировали в 2% агарозном геле с добавлением 0,5 мкг/мл этидия бромида. Фотодокументирование результатов проводили в системе для гель-документации «VersaDoc» с использованием программы «Quantity One v 4.6.9» (Bio-Rad, США). Статистическая обработка результатов проводилась с использованием программы Microsoft Office Excel 2007 (Microsoft Inc.). РЕЗУЛЬТАТЫ В работе было использовано 10 типичных штаммов V. cholerae биовара Эль Тор и 12 штаммов геновариантов, вызвавших соответственно вспышки холеры в 1970 - 1990 и 1993 - 2001 гг. На первом этапе было проведено ПЦР тестирование взятых для анализа штаммов на наличие основных генов патогенности, пандемичности и жизнеобеспечения. В результате установлено, что типичные штаммы и геноварианты отличаются между собой только по структуре профага вирулентности СТХф. Типичные штаммы Эль Тор вибрионов содержат аллель ctxB3 и rstREltor, что указывает на присутствие в их геноме профага(ов) СТХф Эль Тор типа. В то же время, геноварианты содержат ctxB1, но разные аллели гена rstR. Большая часть (60%) имеет как Характеристика штаммов V. cholerae биовара Эль Тор, rstRClass, так и rstREltor, что указывает истжтомшьк в раб°те на наличие двух профагов СТХф - классического (ctxB1 и rstRClass) и гибридного (ctxB1 и rstREltor). Остальные (40 %) штаммы геновариантов содержат только гибридный(е) профаг(и) СТХф (табл.). Штамм Место и Структура профага СТХф год выделения аллель ctxB* аллель rstR** Типичные Эль Тор вибрионы М887 Астрахань, 1970 ctxB3 rstREltor М888 Астрахань, 1970 ctxB3 rstREltor М1013 Башкортостан, 1972 ctxB3 rstREltor М1261 Пермь, 1990 ctxB3 rstREltor С402 Ставрополь, 1990 ctxB3 rstREltor Геноварианты Эль Тор М1264 Краснодар, 1993 ctxB1 rstREltor М1270 Татарстан, 1993 ctxB1 rstREltor/ rstRClass М1293 Дагестан, 1994 ctxB1 rstREltor/ rstRClass М1266 Пермь, 1994 ctxB1 rstREltor/ rstRClass М1345 Татарстан, 2001 ctxB1 rstREltor Примечание. * ctxB3 - аллель Эль Тор типа, ctxB1 - аллель классического типа; ** rstREltor - аллель Эль Тор типа, rstRClass - аллель классического типа. Далее взятые для исследования штаммы были подвергнуты действию осмотического и оксидативного стресса. В результате установлено, что через 40 мин инкубации в солевом растворе количество выросших клеток типичных штаммов и геновариантов было практически одинаковым. Однако через 60 мин количество выживших бактерий геновариантов было в 3,0 - 25,0 раз больше, чем у типичных штаммов (рис. 1). Через 90 мин инкубации в популяции типичных штаммов жизнеспособными оставались единичные клетки (от 1 до 5 в зависимости от штамма), а популяция геновариантов включала от 280 до 560 колоний. К концу эксперимента (через 120 мин) живые бактерии у типичных штаммов отсутствовали, в то же время, у геновариантов вырастали единичные колонии (от 5 до 12 в зависимости от штамма). Подобную картину наблюдали и после действия оксидативного стресса. Количество выживших клеток геновариантов через 6 мин было в 4,3 - 7,6 раза больше, чем у типичных штаммов (рис. 2). Через 10 мин инкубации в растворе перекиси водорода в популяции типичных штаммов жизнеспособные бактерии отсутствовали, в то же время, у геновариантов вырастали еще единичные колонии. Необходимо отметить, что нами не выявлено взаимосвязи между наличием разных типов профага СТХф (только гибридные или классический/гибридный) и устойчивостью штамма к стрессовым факторам. На следующем этапе работы было проведено изучение влияния осмотического и окси-дативного стресса на продукцию ряда факторов, необходимых как для проявления вирулентных свойств, так и выживания во внешней среде. В том числе, была исследована продукция ферментов патогенности (растворимой гемагглютинин/протеазы, фосфоли- Рис. 1. Выживаемость штаммов V. cholerae биовара Эль Тор через 60 мин после действия осмотического (3 моль раствор NaCl) стресса (приведены средние результаты трех опытов). Здесь и на рис. 2: по оси ординат - кол-во выживших клеток, по оси абсцисс: слева - геноварианты, справа - типичные штаммы. Рис. 2. Выживаемость штаммов V. cholerae биовара Эль Тор через 6 мин после действия оксидативного (20 ммоль раствор перекиси водорода) стресса (приведены средние результаты трех опытов). пазы) и гемолизина, а также подвижность. В результате установлено, что после действия осмотического стресса как у типичных штаммов, так и геновариантов продукция растворимой гемагглютинин/протеазы, фосфолипазы, гемолизина статистически достоверно не изменялась. В то же время, у всех исследуемых штаммов было выявлено снижение в 2 - 3 раза подвижности. Однако при последующем пассаже штаммов геновариантов, полученных после действия осмотического стресса на обычных питательных средах, используемых для культивирования штаммов холерного вибриона, их подвижность возвращалась к исходным значениям, в отличие от типичных штаммов, которые оставались малоподвижными. При исследовании фенотипических свойств типичных штаммов и геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор, полученных после действия оксидативного стресса, достоверных различий в продукции гемолизина, ферментов патогенности (растворимой гемаг-глютинин/протеазы, фосфолипазы), а также подвижности выявлено не было. Возможно, изменения в биосинтезе изученных факторов не происходили в результате кратковременного (10 - 15 мин) влияния данного стрессового фактора. Далее был исследован механизм устойчивости штаммов геновариантов к действию стрессовых факторов. Согласно данным литературы один из механизмов выживаемости штаммов холерных вибрионов в условиях осмотического и оксидативного стресса связан с продукцией на поверхности клеток дополнительного экзополисахаридного слоя (ЭПС) [23]. Действительно, при изучении выживших клеток V. cholerae биовара Эль Тор после действия повышенных концентраций соли методом атомно-силовой микроскопии было выявлено, что дополнительный экзополисахаридный слой присутствует как на поверхности клеток геновариантов, так и типичных штаммов. Однако исследование динамики формирования ЭПС показало, что данный слой у геновариантов начинает синтезироваться в более ранние сроки, чем у типичных штаммов. Так, на поверхности клеток геновариантов, подвергшихся действию осмотического стресса, ЭПС присутствует уже через 40 мин инкубации, в то же время, у типичных штаммов он не обнаруживается (рис. 3) и выявляется только спустя 90 мин инкубации, когда в популяции остаются жизнеспособными единичные клетки. При исследовании бактерий типичных штаммов и геновариантов, подвергшихся действию оксидативного стресса, наличие ЭПС на поверхности клеток обнаружено не было. Заключительный этап работы был посвящен исследованию структуры генома штаммов геновариантов, подвергшихся действию оксидативного и осмотического стресса, методом ПЦР. Как известно, из внешней среды могут выделяться штаммы V. cholerae, утратившие ряд мобильных генетических элементов, при этом участие осмотического и осмолярного стресса в реорганизации генома штаммов холерного вибриона не исследовано. Для анализа были взяты единичные бактерии, выжившие на последних минутах эксперимента (8 - 10 мин после действия перекиси водорода и 90 - 120 мин после инкубации в растворе Рис. 3. АСМ изображение клеток типичных штаммов (А) и геновариантов (Б) V. cholerae биовара Эль Тор, полученное через 40 мин после действия осмотического стресса (3 моль раствор NaCl). Стрелки - ЭПС. соли). Все полученные клоны были проверены на наличие структурных и регуляторных генов, входящих в состав 6 мобильных генетических элементов (МГЭ): профагов CTXф (ctxA, cep, zot, ace) и RS^ (rstC), островов патогенности VPI-1 (tcpA, toxT) и VPI-2 (nanH), островов пандемичности VSP-I (deo017, tnp0185) и VSP-II (vc0492, vc0496, vc0512, vc0516). В результате показано, что все изученные типичные штаммы после действия данных стрессовых факторов стабильно сохраняли изученные гены, в то же время, в популяции штамма геноварианта V. cholerae М1264 выявлено три вида клонов: сохранивший все тестируемые МГЭ, утративший профаг RS^ и лишенный острова пандемичности VSP-I. ОБСУЖДЕН И Е Обнаружение Nair G.B. et al. [18] в Бангладеш новых вариантов V. cholerae биовара Эль Тор, продуцирующих холерный токсин классических вибрионов, способствовало активному выявлению данных штаммов в разных странах мира и изучению структуры их генома. Однако быстрое распространение геновариантов и вытеснение ими типичных штаммов, вызвавших текущую пандемию, указывает на необходимость изучения не только молекулярно-генетических, но и экологических свойств данных штаммов, в том числе, устойчивости к различным стрессовым факторам. В данной работе были проведены эксперименты по сравнению устойчивости типичных штаммов и геновариантов к действию осмотического и оксидативного стресса. Оксидативный стресс обусловлен действием активных форм кислорода (АФК), таких как супероксид-анион, перекись водорода, гидроксид-радикал, которые повреждают белки, ДНК и мембраны бактерий. С АФК холерный вибрион встречается как в организме человека, так и во внешней среде, так как АФК являются частью иммунного ответа хозяина и участвуют в уничтожении вторгшихся бактерий, а также постоянно образуются в водоемах при разложении органических соединений под действием ультрафиолетовых лучей [24]. Высокая концентрация соли образуется в небольших водоемах с морской водой (эстуарии), в которых обитает холерный вибрион, при их подсыхании. Доказано, что устойчивость и выживание патогена в соленых водоемах играет важную роль в персистенции холеры и возникновении новых эпидемий [22]. Взятые в данном исследовании типичные штаммы и геноварианты отличались между собой только по структуре профага СТХф. При этом присутствие аллеля ctxB1 в геноме геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор привело к увеличению ими продукции холерного токсина, что было установлено нами ранее [3]. Однако возникает вопрос, влияет ли приобретение нового генетического материала (профага СТХф) на выживаемость геновариантов при действии различных неблагоприятных факторов? В результате проведенных исследований выявлено, что геноварианты V. cholerae биовара Эль Тор более устойчивы, как к действию осмотического, так и оксидативного стресса, что, возможно, способствует их большей выживаемости во внешней среде. При этом показано, что высокая концентрация соли угнетает подвижность штаммов. Данный факт вполне объясним, учитывая, что жгутик холерного вибриона приводится в движении с помощью электрохимического натриевого трансмембранного потенциала или SMF (sodium motive force), который создается в результате работы Na+^ранспортирующей NADH-убихинон редуктазы. Повышение концентрации ионов натрия в окружающей среде приводит к снижению активности редуктазы и, как следствие, к уменьшению Na+шотенциала и снижению подвижности [14, 16]. Однако после пассажа штаммов геновариантов, подвергшихся осмотическому стрессу, на обычных питательных средах их подвижность восстанавливалась в отличие от типичных штаммов. Как известно, неподвижные (или малоподвижные) вибрионы не способны преодолевать слизистый слой кишечника и прикрепляться к эпите-лиоцитам, а при обитании в водоемах не формируют биопленку и уничтожаются простейшими [12, 17]. Учитывая данный факт, можно предположить, что восстановление подвижности в штаммах геновариантов после снятия стрессовых факторов указывает на их способность лучше адаптироваться к смене среды обитания, в отличие от типичных штаммов. Исследование механизмов устойчивости штаммов геновариантов к стрессовым факторам показало, что геноварианты при нахождении в среде с высокой концентрацией соли начинают продуцировать экзополисахарид раньше, чем типичные штаммы. Возможно, именно способность геновариантов быстро перестроить метаболизм клетки и начать биосинтез ЭПС в ранние сроки спасает популяцию от гибели. Механизм устойчивости геновариантов к перекиси водорода не выявлен. Учитывая важную роль каталазы OxyR в защите индивидуальных клеток V. cholerae от действия Н2О2 [24], а также участие биопленки в защите популяции от различных стрессовых факторов [11], можно предположить, что большая устойчивость геновариантов к перекиси водорода обусловлена высокой экспрессией каталазы штаммами геновариантов и/или их повышенной способностью к формированию биопленки. Однако для подтверждения данного предположения необходимо проведение дальнейших исследований. Важными, на наш взгляд, являются данные об участии осмотического и оксидативно-го стресса в реорганизации генома штаммов геновариантов. Как известно, в настоящее время глобальное распространение в мире получили новые штаммы геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор, имеющие обширную делецию в острове пандемичности VSP-II [20]. К сожалению, в данном исследовании нам не удалось получить клоны геновариантов с делецией в VSP-II, и необходим поиск других факторов внешней среды, приводящих к реорганизации в данном МГЭ. Однако нами получены изогенные клоны геноварианта, лишенные других МГЭ (профага RS^ и острова пандемичности VSP-I), которые могут быть использованы при проведении модельных экспериментов по исследованию влияния делетированных МГЭ на биологические свойства штаммов геновариантов. Таким образом, при исследовании влияния осмотического и оксидативного стресса на штаммы геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор установлено, что изменение в структуре профага вирулентности СТХф (приобретение аллеля ctxB1) привело не только к усиление вирулентности геновариантов, но и обеспечило им большую устойчивость к стрессовым факторам. При этом один из выявленных механизмов повышенной устойчивости геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор к высокой концентрации соли связан с продукцией на поверхности клеток дополнительного экзополисахаридного слоя в более ранние сроки, чем у типичных штаммов. Также показано, что осмотический и оксидатив-ный стресс является причиной реорганизации генома геновариантов и приводит к утрате ряда мобильных генетических элементов. Полученные изогенные клоны геновариантов (с интактными и делетированными МГЭ) могут быть использованы для изучения влияния делетированных МГЭ на вирулентные свойства штаммов V. cholerae, метаболизм клеток, а также на их выживаемость при нахождении как в макроорганизме, так и во внешней среде.

About the authors

S. P Zadnova

Russian Research Institute of Plague Control «Microbe»

N. A Plekhanov

Russian Research Institute of Plague Control «Microbe»

I. M Krepostnova

Russian Research Institute of Plague Control «Microbe»

P. S Erokhin

Russian Research Institute of Plague Control «Microbe»

N. I Smirnova

Russian Research Institute of Plague Control «Microbe»

References

Supplementary files