EFFECTIVENESS OF POLYCATIONIC NANOPARTICLES OF POLYETHYLENEIMINE-POLYHYDROZIDE-CHITOSAN (PEI-PG-OCHG) AS A VECTOR FOR SMALL INTERFERING RNA, DIRECTED TO SUPPRESS HERPES SIMPLEX TYPE 2 VIRUS REPLICATION

Full Text

ВВЕДЕНИЕ В последние годы активно разрабатывается принципиально новый геннотерапевтический подход к лечению и профилактике вирусных инфекций, в основе которого лежит использование комплементарно адресованных полинуклеотидов (КАП). К данному типу соединений традиционно относят антисмысловые РНК, ДНК, рибозимы и другие соединения. Открытие Э. Файром и К. Мелло [9] явления РНК-интерференции, т.е. биологического механизма управления активностью генов посредством коротких двухцепочечных РНК и специальных белковых комплексов, вызывающих селективную деградацию определенных мРНК или подавление трансляции многих мРНК в клетке, привело к появлению нового класса КАП - малых интерферирующих РНК. На основе описанного исследователями механизма были разработаны методы направленного подавления активности генов с помощью коротких синтетических РНК-дуплексов, которые могут быть созданы против любой мРНК благодаря тому, что последовательность генома многих макроорганизмов, включая человека, уже известна [10]. В настоящее время активно изучаются перспективы применения РНК-интерференции в медицине с целью лечения заболеваний различной этиологии, включая инфекционные, онкологические и др. [8, 12, 16]. Известно, что репликация значительного числа вирусных агентов, в том числе, вирусов герпеса человека, может подавляться с помощью малых интерферирующих РНК (миРНК). Герпесвирусные болезни представляют собой серьезную медикосоциальную проблему, являясь одними из наиболее распространенных инфекций человека с множественной симптоматикой. Для заболеваний, вызываемых вирусом простого герпеса (ВПГ), характерно пожизненная персистенция возбудителя в латентном состоянии в организме хозяина. При этом, эпизодически, инфекционный процесс приобретает активную форму, поражая различные органы и системы [2, 4]. Характерным для герпесвирусных инфекций является также атипичное течение и развитие вторичного иммунодефицита. При лечении больных герпетической инфекцией основная задача состоит в применении эффективного терапевтического подхода, направленного, в первую очередь, на увеличение срока ремиссии болезни [5]. Исход заболевания, вызванного ВПГ, во многом зависит от реальных возможностей организма противодействовать вирусу с помощью иммунных механизмов, подавляя процессы репликации и реактивации вируса. При попытках использования генной терапии вирусных инфекций при моделировании in vitro, и особенно in vivo, возникает одна существенная проблема, которую принято называть «проблема доставки КАП». Дело в том, что нуклеиновые кислоты (НК) обладают отрицательным зарядом, поверхность клеток также несет избыточный отрицательный заряд, поэтому пассивное проникновение НК в клетку-мишень очень затруднительно. Кроме того, НК нуждаются в защите от повреждения нуклеазами. Поэтому одновременно с развитием технологии КАП идет процесс создания для НК различных типов носителей [11]. Ранее нами были синтезированы производные полиэтиленимина, содержащие ацилгидразидные боковые группы (ПЭИ-ПГ). При этом было показано, что молекулы ПЭИ-ПГ образуют с плазмидной ДНК наночастицы, способные эффективно трансфицировать различные клетки млекопитающих in vitro. Было установлено, что молекулы «модельного лиганда» - N-сукцинилированного ограниченно деполимеризованного хитозана, содержащие альдегидную группу, способны ковалентно связываться с наночастицами ДНК-ПЭИ-ПГ, при этом эффективность трансфекции in vitro значительно возрастает [3]. Целью работы была оценка противовирусного действия миРНК в составе наночастиц ПЭИ-ПГ-ОХГ к мРНК белка vp16 (ген UL48) ВПГ-2 in vitro. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Использовали: 50% водный поиэтиленимин (BDH, Великобритания), хитозан (Сонат, РФ), содержащий около 15% N-ацетилированных глюкозаминовых звеньев, гидразин-гидрат и другие химические реактивы (Химмед, РФ), а также перевиваемую линию клеток Vero и вирус простого герпеса 2 типа (штамм MS) из коллекции вирусов лаборатории диагностики вирусных инфекций НИИВС им. И.И. Мечникова. К монослою клеток Vero во флаконах (Greiner, Германия) добавляли 1 мл раствора трипсин-версена (1:1). Инкубацию проводили при 37°С в течении 10 минут. Затем во все флаконы добавляли по 2 мл полной культуральной среды DMEM c 7,5% эмбриональной телячьей сыворотки и с помощью автоматической пипетки доводили суспензию клеток до образования гомогенной клеточной взвеси. Далее к % содержимого флакона добавляли 3/4 полной культуральной среды и инкубировали при 37°С в атмосфере 5% СО2. Пересев клеток в культуре Vero проводили каждые 3 - 4 дня. 100 мкл (0,5х106 кл./мл) взвеси клеток из одного флакона вносили в каждую лунку 96-луночного плоскодонного планшета, который затем инкубировали при 37°С в атмосфере 5% СО2 в течение 24 ч. Монослой клеток Vero в лунках планшета однократно отмывали средой Игла, далее в каждую из лунок добавляли по 180 мкл среды DMEM. В первый ряд лунок планшета вносили по 200 мкл исходной вируссодержащей жидкости. В следующие ряды лунок вносили по 20 мкл жидкости из ранее заполненных лунок. Инкубацию проводили при 37°С в атмосфере 5% СО2. Краситель Neutral Red (NR) (3,33 г/л) разбавляли в 3 раза (до конечного объема 1,11мг/мл). На 5 сутки после заражения клеток в каждую лунку, предварительно удалив из них культуральную среду, добавляли по 50 мкл раствора красителя. Далее планшет инкубировали в течение 2 ч при 37°С в атмосфере 5% СО2. После инкубации монослой клеток трижды отмывали средой Игла. В каждую лунку вносили по 100 мкл раствора (50% EtOH/50%. 01М NH4H2PO4, pH = 3,5) и через 30 минут инкубации оценивали результат с помощью спектрофотометра при длине волны 490 нм. МТТ-тестирование проводили, используя модифицированную методику, описанную Niks M. и Otto M [6]. В каждую лунку с монослоем клеток вносили по 50 мкл раствора МТТ (1,5 мг/мл) и инкубировали в течении 2 ч при 37°С в атмосфере 5% СО2. Затем монослой клеток трижды отмывали средой Игла от красителя. В каждую лунку добавляли по 100 мкл раствора ДМСО и через 15 мин инкубации оценивали результат на спектрофотометре при длине волны 490 нм. Праймеры и зонды для ПЦР-РВ были моделированы в компьютерной программе Vector NTI 8,0 в соответствии с последовательностями мРНК исследуемых генов (последовательности мРНК были взяты в GenBank) и синтезированы в фирме Синтол (РФ) (табл. Таблица 1. Последовательности праймеров, использованных в работе Праймер 5’-3’ последовательность Длина UL48 Ulf Ulr CCC-ACC-CTG-CCC-GCC-AC TTA-GCT-CCC-GCA-GTC-GCC 22 22 1). Для приготовления ПЦР-смеси в реакциях использовали Hot Start Taq DNA Polymerase (СибЭнзим, РФ). Для определения экспрессии гена актина помимо имеющейся системы использовали «Набор реактивов для обнаружения и определения кДНК Р-актина человека» (Синтол, РФ). Программное обеспечение прибора АНК-32 позволило получить данные по пороговому циклу. Далее с использованием калибровочных прямых получали сведения о количестве копий РНК. Статистический анализ проводили с использованием общепринятых статистических методов, рассчитывая среднее арифметическое (Х), Х=х^п; дисперсию (2), 2=(xi-X)2/n; среднее квадратичное отклонение (х), x=(xi-X)2/n, где xi - значение варианта, n - число экспериментов. Применяли также компьютерную статистическую программу BioStat и программу Excel. В связи с разным числом наблюдений в каждой из групп для оценки статистической достоверности различий экспрессии генов в исследуемых группах использовали непараметрический критерий Манна-Уитни [13]. РЕЗУЛ ЬТАТЫ Для оценки эффективности препарата ПЭИ-ПГ-ОХГ мы проводились эксперименты по определению противовирусного действия миРНК к мРНК гена UL48 ВПГ-2 (штамм MS) в культуре клеток Vero. С помощью программы Dramacon Co. были подобраны возможные варианты миРНК к последовательности транскрипта гена UL48 ВПГ-2 и синтезированы три варианта миРНК: SR1, SR2, SR3. Последовательности компонентов конструктов представлены в табл. 2. Известно, что для исследования противовирусного действия различных препаратов часто используют культуру клеток Vero. При этом препараты могут вызывать в культуре цитотоксический эффект. Существует возможность визуального отличия цитотоксического действия препарата от цитопатического действия вируса, в наших исследованиях было решено исключить цитотоксический эффект препарата. Коллектив авторов предпринял попытку разработки нового подхода для создания универсальных носителей, в которых была бы предусмотрена возможность присоединения необходимых лигандов после получения компактизованных комплексов с ДНК. Было продемонстрировано, что препарат ПЭИ-ПГ-ОХГ отвечает поставленной задаче. Мы провели эксперименты, целью которых была оценка противовирусного действия миRNA к мРНК гена UL48 ВПГ-2 в культуре клеток Vero. С помощью программы Dramacon Co были подобраны возможные варианты миRNA к последовательности гена UL48 ВПГ-2. В дальней-Таблица 2. Последовательность компонентов кон- шем синтезированы три варианта структов миRNA: SR1, SR2, SR3. Вариант миРНК Нуклеотидная последовательность SR-1 5’-UU CUGCAUC UAUACCUCUU dTdT-3’ 3’-dTdTAAGACGUAGAUAUGGAGAA-5’ SR-2 5’-GAGUUUGAACAGAUGUUUA dTdT-3’ 3’-dTdTCUCAAACUUGUCUACAAAU-5’ SR-3 5’-UGUUGGUCGACGAUCUGUU dTdT-3’ 3’-dTdTACAACCAGCUGCUAGACAA-5’ В экспериментах по определению цитотоксичности как комплексов, так и отдельных компонентов было показано, что используемые разведения препарата ПЭИ-ПГ-ОХГ (1:1000, 1:500, 1:100) и 3 варианта миРНК (10 и 40 нг) не оказывают токсического действия на клетки Vero в культуре. При использовании комплексов ПЭИ-ПГ-ОХГ в соотношении 1:1000 и 1:500 совместно с миРНК цитотоксического действия также не было выявлено. Исследования комплексов с содержанием ПЭИ-ПГ-ОХГ в соотношении 1:100 с миРНК показало, что цитотоксической активностью обладают комплексы ПЭИ-ПГ-ОХГ (1:100)^RNA(40 нг). Рис. 1. Схема эксперимента по определению противовирусного действия препаратов ПЭИ-ПГ-ОХГ/миРНК. В дальнейших экспериментах выбранные дозы комплексов были использованы для определения противовирусного действия препаратов. При исследовании цитотоксичности комплексов с содержанием ПЭИ-ПГ-ОХГ (1:100) с миRNA лишенными токсичности оказались комплексы ПЭИ-ПГ-ОХГ (1:100)/ миRNA (10 нг), которые также тестировались в культуре клеток Vero на наличие противовирусной активности. В культуральной жидкости (лунки с ВПГ-2, 0,01ТЦД50/кл.) определялся титр вируса - «вирусное потомство». Схема эксперимента представлена на рис. 1. Логарифм титра ВПГ-2 в контроле составил 5,5 ТЦД50/0,1мл. Титр «вирусного потомства» в контрольных образцах (контроль S1, S2, S3 конструктов, контроль poly) статистически не отличался от контроля вируса, логарифм титра находился в пределах 4,5 - 5,5 ТЦД50/0,1 мл. В опытных образцах с концентрацией конструкций 20 нг/ лунку титр вновь продуцируемого вируса определялся в диапазоне 3,0 - 5,34 ТЦД50/ 0,1 мл. Наиболее выраженный противовирусный эффект был выявлен у конструкции S2. В результате проведенных экспериментов было установлено, что конструкции миRNA к вирусному гену UL48 эффективны и обладают выраженным противовирусным действием, которое выражается в снижении титра «вирусного потомства», более чем в 100 раз относительно контроля. Наиболее значительным противовирусным действием обладал конструкт S2, мишень которого была расположена в центре мРНК вирусного белка VP-16 . Противовирусное действие миРНК основано на деградации мРНК UL48 c помощью интерферирующей РНК. В данной работе помимо противовирусного действия Рис. 2. Снижение уровня экспрессии гена UL48 при действии mhRNA. Значения достоверно отличаются от контроля (p<0,05). была изучена экспрессия мРНК UL48 под воздействием различных вариантов миRNA (S1, S2, S3) (рис. 2). Наиболее выраженным блокирующим действием обладал вариант S2 (уровень экспрессии исследуемого гена снижался в 45 раз). На основании полученных данных можно предполагать, что вариант S2 миРНК, который связывается с центральной областью молекулы мРНК гена UL48, обладает максимально выраженной противовирусной активностью и может в дальнейшем быть использован для определения противовирусного действия. Также следует отметить, что предранний белок VP16 играет значительную роль в процессе репродукции вируса в клетке (с помощью данного белка происходит транскрипция генов вирусных ферментов) [14]. ОБСУЖДЕНИЕ Несмотря на определенные успехи, достигнутые в последние годы в лечении и профилактике вирусных инфекций, поиски новых подходов к борьбе с вирусными заболеваниями по-прежнему весьма актуальны. К числу таких подходов, несомненно, относятся технологии создания искусственного противовирусного иммунитета и генной терапии с помощью комплементарно адресованных полинуклеотидов. Ранее основными представителями КАП являлись антисмысловые РНК (асРНК), рибози-мы и антисмысловые олигодезоксирибонуклеотиды (асОДН). Однако в последние годы внимание разработчиков КАП все более сосредоточивается на малых интерферирующих РНК (миРНК) как наиболее прецизионных и мощных противовирусных агентах [17]. Тем не менее, по-прежнему остается актуальной проблема доставки КАП в клетки и ткани-мишени, где разворачиваются основные события репликации вирусов. Для доставки молекул экзогенных нуклеиновых кислот или генов в клетки используются носители (векторы), которые можно разделить на векторы вирусной и невирусной природы. Вирусные векторы обладают высокой эффективностью переноса генов, однако существуют различные, часто неизвестные аспекты безопасности, включающие патогенность, иммуногенность и цитотоксичность. В связи с этим, основное внимание уделяется разработке более безопасных не вирусных векторов. К числу последних относятся различные липидные структуры, в том числе липосомы, катионные липиды и др., которые наряду с относительно высокой трансфицирующей активностью обладают и характерными недостатками - физико-химической нестабильностью, техническими сложностями при хранении и применении. Значительно больший интерес вызывают разработки поликатионных соединений. В 1995 г. Boussif O. et al. [7] удалось достигнуть эффективной трансфекции клеток мышиных фибробластов линии 3Т3 и клеток почек обезьян НерG2 с помощью комплексов ДНК с полиэтиленимином (ПЭИ). Известно, что ПЭИ содержит первичные, вторичные и третичные аминогруппы, поэтому нами было принято решение синтезировать препараты хитозана, содержащие N-этил- и N-диметиламиногруппы с целью усиления ионного взаимодействия между хитозаном и ДНК и повышения эффективности трансфекции. Полученные результаты свидетельствуют о том, что как модифицированный хитозан (mCHIT), так и ПЭИ трансфицируют адгерентные клеточные линии примерно с одинаковой и достаточно высокой эффективностью [1]. Поэтому нами были созданы молекулярные комплексы, содержащие полэтиленимин, с которым через ацил-гидразидные мостики ассоциирован хитозан. Эти комплексы способны компактно связывать ДНК и представляют собой наночастицы, обеспечивающие высокоэффективную трансфекцию клеток млекопитающих различного тканевого генеза [3]. Этот молекулярный комплекс использовался нами как для изучения возможности доставки миРНК в клетки Vero, пермиссивные для вируса простого герпеса 2 типа, так и изучения противовирусного действия миРНК в составе наночастиц ПЭИ-ПГ-ОХГ к мРНК белка vp16 (генUL48) ВПГ-2 in vitro. Ген UL48, точнее кодируемая им мРНК белка vp16 ВПГ-2, была выбрана в качестве мишени для миРНК не случайно. Этот вирусный белок играет важную роль в процессе репликации и формировании тегумента ВПГ-2. Ранее Palliser D. et al. [15] удалось показать выраженный протективный противовирусный эффект с помощью миРНК-содержащих микрочастиц. Интравагинальное введение самкам мышей зараженных ВПГ-2, смеси миРНК против генов UL27 и UL29 (кодирующих соответственно поверхностный гликопротеид и ДНК-связывающий белок) с липидами предотвращало гибель мышей от генитальной ВПГ-2 инфекции. В нашей работе мы впервые использовали для изучения противовирусного действия в качестве носителя поликатионное соединение ПЭИ-ПГ-ОХГ, содержащее миРНК к мРНК белка vp16 (генUL48) ВПГ-2. Полученные результаты могут быть использованы при создании новых терапевтических препаратов против герпесвирусов. Л ИТЕРАТУРА

About the authors

A. S Borisenko

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Moscow, Russia

O. A Svitich

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Moscow, Russia

G. G Krivtsov

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Moscow, Russia

V. F Lavrov

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Moscow, Russia

V. S Popova

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Moscow, Russia

T. M Parfenova

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Moscow, Russia

References

Supplementary files