POSSIBILITY OF USING NESTED POLYMERASE CHAIN REACTION FOR DIAGNOSTICS OF DISEASES CAUSED BY VARICELLA ZOSTER VIRUS

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Патогенный для человека вирус Varicella Zoster (VZV) относится к семейству герпесвирусов и классифицируется как герпесвирус 3 типа [5]. К особенностям жизненного цикла следует отнести отсутствие природного «депо» (хозяином вируса является исключительно человек), а также способность переходить в латентное состояние после первичной инфекции. Считается, что у практически всех переболевших вирус в латентной форме персистирует в нервных узлах в течение неограниченного времени и сохраняет способность к реактивации, вызывая вторичную инфекцию. Характерными клиническими проявлениями VZV являются ветряная оспа (varicella, chickenpox) при первичном инфицировании или опоясывающий лишай (zoster, shingles) во время вторичной инфекции, вызванной либо диким вирусом, либо реактивацией латентной формы. Однако описаны случаи осложнений заболевания, не всегда сопровождающиеся высыпаниями, а также вирусассоциированные патологии и бессимптомное течение инфекции [3], что затрудняет диагностику. Цель работы - разработка способа определения ДНК вируса в клинических образцах с помощью двухступенчатой (nested) ПЦР (амплифицируя ДНК, выделенную из лейкоцитарной фракции периферической крови пациентов). МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Для приготовления растворов использовали бидистиллированную воду, дополнительно деионизированную на колонке прибора Millipore Simplicity UV, удельное сопротивление воды составляло 18 мегаОм/см. В работе использовали Taq полимеразу производства «Синтол» и «Сибэнзим», а также высокоточную ДНК полимеразу Phusion (BioRad) для клонирования положительной контрольной ДНК VZV. Синтез и очистку праймеров заказывали на фирме «Синтол». Анализ нуклеотидных последовательностей, в том числе конструирование и анализ олигонуклеотидов, проводили, используя пакет программ Vector NTI. Выделение мононуклеарных клеток из периферической крови проводили путем центрифугирования гепаринизированной венозной крови в градиенте плотности фиколл-верографина [1]. Для выделения ДНК клетки лизировали с помощью инкубирования в течение часа при 55°С в 1% растворе додецилсульфата натрия и 300 мкл буфера, содержащего 40 mM трис-HCl (pH 7,5), 10mM ЭДТА и 100 mM NaCl, с добавлением протеиназы К в концентрации 0,02 мг/мл. В дальнейшем образцы ДНК выделяли из клеток либо фенол-хлороформной экстракцией [4] с последующим осаждением этанолом, либо с помощью набора DNA Prep 100 фирмы «Изоген». При проведении ПЦР в качестве положительного контроля использовали фрагмент гена VZV, содержащий открытые рамки считывания 67 и 68, клонированный в плазмиде pGEM-T easy (Promega). Искомый клон получали с помощью амплификации ДНК вируса, выделенной фенол-хлороформной экстракцией из вакцины Varilrix (Бельгия), с использованием Phusion ДНК полимеразы (BioRad), праймеров ACAACAAGGATAAAACACGG (прямой) и TAAATTTACACGCTCGACGT (обратный) в условиях, рекомендованных производителем, с последующей обработкой ПЦР продукта Taq полимеразой, лигированием в плазмиду и трансформацией лигирующей смесью компетентных клеток СС001 (Евроген) с ампициллиновой и белоголубой селекцией клонов. Последовательность вставки подтверждали сиквениро-ванием. Анализ выделенных образцов ДНК проводили путем двухступенчатой ПЦР, амплифицируя фрагмент ДНК, кодирующий часть открытой рамки считывания 67, как показано на рис. 1. На первой стадии амплифицировали фрагмент ДНК длиной 677 пар нуклеотидов с помощью пары праймеров F1 и R1, полученные реакционные смеси использовали в качестве ДНК матриц во второй реакции с использованием пары праймеров F2 и R2, в результате которой получали ДНК длиной 446 пар нуклеотидов. ПЦР проводили в объеме 25 мкл в буфере фирмы-производителя Taq полимеразы с конечной концентрацией хлористого магния1,5 mM с добавлением 0,25 mM смеси дезоксинуклеотидтрифосфатов, 1 mcM праймеров и 0,5 ед. фермента. Программа амплификации: 94°С - 10 мин; 30 циклов: 94°С - 1 мин, 60°С - 2 мин, 72°С - 2 мин; 72°С - 5 мин. [11]. Полученные ПЦР продукты анализировали с помощью электрофореза в 1,6% агарозном геле при добавлении этидиум бромида до конечной концентрации 0,2 мкг/мл. РЕЗУЛ ЬТАТЫ В работе использовали клинический материал, полученный в московской инфекционной клинической больнице № 1 у двух групп пациентов. Первая группа состояла из 35 человек с клиническими проявлениями опоясывающего лишая, а вторую контрольную группу (20 пациентов) составили практические здоровые доноры. Сначала из венозной крови пациентов, обработанной гепарином в количестве 20 ед. на 1 мл цельной крови, получили фракцию мононуклеарных клеток путем центрифугирования в градиенте плотности фиколл-верографина (р=1,077), затем клеточный осадок лизировали, обрабатывали протеиназой К и выделяли тотальную клеточную ДНК либо фенол-хлороформной экстракцией, либо используя набор для выделения DNA Prep 100. На последней стадии выделения ДНК высаживали двумя объемами этанола из раствора, двумолярного по ацетату аммония, осадок дополнительно про- ATOCGGAGTC TACGCCTCAS GATCATAAGT (■iThuVTATTGA AEAGAADGCA TCTCTT3CGT ATAWGGGGA TATOGCCcCT (ZTTiCOMAf:C GArtCOGtTGG CAfiAOATAAA отсгстйттт AAOGAGATCT TTGCTC7AGA GTGGAAGAftA GftGGTTGTTT TGSAGT7CGG ACGTCAGGCC CGSGAGACGC GCOCTC7GCG TGCTTTGAAG ACSftAAGTTC GGATCASTTG CCTAGTCAAC ADCAADCGTG TGSTTGSCAC TTCATMGTA aa&tacccai ' caccttatat GTV>3AATATA CACGAAGACC GTGCTIGTG3 AOGGTTAATG tgccaattac АТДГХСОГАТ ТАКООСеТА ATTGTAAATG ТАДОДТТТАГ: ТЛАТССЙДЙА MTAJGGTTTT ATCAJDCCGTT TAGTQGGCflA TACACCGAGA ATGTGGCTCT A9CGCCCG0C TCGCGGGCGG ACGTGC-TGGT ТССПССАССА GCCGAAATCA CGGCTITA^1 GATTGTTGTA СТААСААСАГ 1 ccgtatatga аееттАстАС caticagaiy: авСАТМйСТ оссаатуаго gtaagtctag 51 AAPCGGGGPfi AGTCTTCGCG AAAAGCGTAC TTAGCOCCTC TCAGAAi^CGC TTTTCGCATG LU1 ATKCCACGT AATGATTA3G ATGGATTrTT TAZCGC-TGCA ТГАСТАЛТАС ЗАОСТААААА L vl ATGGGGTGTA TAATfAGGGC СПТЖТАГСЙ TACCOCACA* ATTA-GTCCCCi (SCAOCATAGC 201 CbACCCACAC AAATtfTGTtt: АОАОПДОСДТ RTTOrajIGr-j TTTACPiOftCJj TGTCCTCCTft 251 CCA0ST1ATC [ХТЛ<ЩТТАЛ ACGSCGAT(jA GCrCCAATAO 8GATSCAMT 7COXCTAjf:T 301 TGGACCAACQ TCAATACGC-T GACGTCTITA AGGTGGTTGC AGTTATGCCA CTGGACAAAT 351 CCCCAAGGDC АААНЙСТСА.Т tGAGGTGTCA GGKT1CCGS ТГТОТСАСГА AGTGGACAGT lOl TACTT7ACGC GCACCGATGC AGOGGAT7TA ATGAAMGOG OSTGGCTAAG "ГСбССТАДАТ 151 CTrGGAGCTI TTTGCEGTCA TTAACCTGTA GAACCTCGAA AAJLCGGCAGT AATTGGACAT 501 ATCCAKZATA TATGTTTAnA ACATACAftCA ТАМТССТАГ АТАСАДАТГТ 7GTATGTTGT 551 GGATGIGGAr HGCGOGGAAA ATACTAAAGA ССГАСАССТА ACGCGCCT7T IAIGATITCT 601 GTrACCGT'iT TCAAQGTAAG AAGGAAGCGG GAATGG-CAAA AGTTOCATK 7TCCTTCGGC 651 AACACGAGCA CACTGTTTGA ТС-ААСГС Т'ГСТеСПСвГ GTGACAAACr ACTTGAG Рис. 1. Схематическое изображение использовавшегося в «двойной» ПЦР фрагмента открытой рамки считывания 67 (ORF67) и соответствующая нуклеотидная последовательность. Отмечены пары праймеров для первой (F1, R1) и второй (F2, R2) реакций, последовательности праймеров выделены жирным шрифтом. Рис. 2. Электрофорез продуктов ПЦР в 1,6% агарозном геле, окрашенном этидиум бромидом. На дорожках 1 - 9 нанесены анализируемые образцы ДНК, 10 - маркеры молекулярных масс 100 bp, 11 и 12 - отрицательный контроль. мывали 70% этанолом, подсушивали и растворяли в 50 - 100 мкл буфера трис-HCl (pH 8,0). При дальнейшем использовании ДНК в ПЦР в течение относительно короткого времени пробы хранили в холодильнике при 4°C, для длительного хранения образцы ДНК замораживали и держали при -20°C. Для амплификации в качестве маркерного фрагмента вирусной ДНК была выбрана последовательность длиной 447 пар нуклеотидов, входящая в открытую рамку считывания 67 и кодирующая фрагмент гена гликопротеина I вируса, как показано на рис. 1. С целью получения искомого фрагмента проводили анализ вирусной ДНК в образцах с помощью двухступенчатой ПЦР с последовательным использованием двух пар праймеров. На первой стадии проводили амплификацию ДНК, используя праймеры, ограничивающие участок длиной 677 пар нуклеотидных остатков (п.н.). Следует отметить, что концентрации ДНК, полученной после первой амплификации исследуемых образцов, было недостаточно для визуализации в агарозном геле, а эффективность прохождения реакции оценивали, используя клонированный фрагмент гена вируса как положительную контрольную ДНК матрицу в полимеразной цепной реакции. На второй стадии проводили амплификацию с использованием второй пары праймеров, ограничивающих фрагмент ДНК размером 447 пар нуклеотидных остатков, причем в качестве матрицы ДНК использовали реакционные смеси, полученные после первой ПЦР. После проведения амплификации реакционные смеси анализировали в 1,6% агарозном геле в присутствии этидиум бромида и визуализировали результаты на приборе для документации гелей (BioRad), как это представлено выборочно по нескольким образцам на рис. 2. Положительными считали образцы, в которых в качестве основного продукта реакции получали ДНК с молекулярной массой, примерно соответствующей 447 п.н., сравнивая ДНК реакционных смесей с маркерами молекулярных масс (дорожка 10); на рис. 2 - это образцы 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, а такие образцы, как 3 и 9, без следов ПЦР продуктов, считали отрицательными. В результате эксперимента ДНК вируса Varicella Zoster была обнаружена у 17 из 35 пациентов (49%) с клиническими проявлениями опоясывающего лишая, а также у 1 из 20 (5%) здоровых доноров. ОБСУЖДЕНИЕ Заболевания, вызываемые вирусом Varicella Zoster, остаются значимой социальной проблемой, несмотря на разработку вакцины и введение в ряде стран вакцинопрофилактики ветряной оспы [2]. Переболевшие являются носителями вируса в латентной форме, и до недавнего времени считалось, что вторичная инфекция возникает исключительно в результате реактивации, так как это было показано в ряде работ с помощью рестрикционного анализа вирусной ДНК [9, 15]. Однако было показано, что в некоторых случаях происходит вторичное инфицирование другим генетическим штаммом, чаще бессимптомное, что дополнительно осложняет эпидемиологическую ситуацию, так как возможна реактивация любого штамма. К примеру, был описан пациент, дважды переболевший опоясывающим герпесом после первичной ветрянки, причем генотип следующего герпеса отличался от предыдущего [10]. Был даже описан случай выделения двух генетических вариантов вируса у ребенка с ветряной оспой [14], что было подтверждено методами полноразмерного сиквенирования. В настоящей работе мы попытались использовать метод двухступенчатой ПЦР, отличающийся относительной простотой и дешевизной, для анализа образцов от пациентов с подтвержденным диагнозом с целью показать возможность использования этого метода для анализа случаев со сложной этиологией, в том числе и бессимптомных. Считается, что вирус можно обнаружить в монону-клеарных клетках крови в течение только первых нескольких дней после реактивации или инфицирования, например, японские исследователи показали наличие ДНК вируса в 60% образцов [11], что несколько выше по сравнению с данными, полученными нами (49%). Однако необходимо подчеркнуть, что мы анализировали 35 образцов крови, в то время как Ito M. et al. [11] только 10, что свидетельствует о более высокой статистической достоверности наших данных. Необходимо также учитывать возможность вирусных мутаций, а также вторичного заражения другим генотипом вируса, что может приводить к ложноотрицательным результатам. Генотипирование образцов, полученных в Москве (20 образцов) и Новосибирске (12 образцов), было проведено Loparev VN. et al. [12] с помощью метода полиморфизма (точечных замен) в сайтах рестрикции эндонуклеаз (BglI в ORF54 и PstI в ORF38), и было показано, что VZV в России относится к европейскому генотипу, позднее классифицированному как Е1 [13]. Однако использование методов полноразмерного геномного сиквенирования для анализа генома ВВЗ позволило выявить три гипервариабельных участка: ORF 1-3, ORF 35-37, ORF 57-68 [10]. Хотя появление мутаций в кодирующей области ORF 67 (gI), влияющих на результаты ПЦР, представляется маловероятным, такую возможность нельзя исключать полностью. Более того, в одной из работ [7] при анализе геномов дикого вируса и культивируемого штамма с помощью полноразмерного геномного сиквенирования было показано, что количество точечных нуклеотидных полиморфных замен (SNP - single nucleotide polymorphism) в диком вирусе существенно выше, чем в культивируемом на низких пассажах штамме: 197 (41 подтвержденная замена) в диком против 42 (6 подтвержденных) в культивируемом. Что же касается обнаружения вирусной ДНК в одном из образцов из пула здоровых доноров, то следует обратить внимание на следующее. Образцы от практически здоровых доноров были получены у переболевших пациентов, излечившихся от опоясывающего лишая и не имевших клинических проявлений инфекции в течение, как минимум, последних 6 месяцев перед забором крови. Другими словами, у всех пациентов контрольной группы, исходя из общих соображений о жизненном цикле VZV, вирус, скорее всего, находился в латентной форме. Поэтому, если отбросить артефакт, здесь можно указать на бессимптомную реактивацию вируса, как, например, было описано при исследовании образцов астронавтов [6], хотя возможен и случай вторичного инфицирования, протекающего также бессимптомно. Точный ответ можно было бы получить, сравнив результаты генотипирования ДНК вируса исследуемого образца с ДНК из образца, полученного у того же пациента в момент острой инфекции. Также для получения более статистически достоверных данных численность пула здоровых доноров должна быть существенно увеличена. Таким образом, метод двухступенчатой ПЦР может быть использован как дополнительное подтверждение реактивации вируса или инфицирования, особенно при анализе нетипичных клинических случаев, вызываемых вирусом (например, неврологических расстройств без высыпаний на коже [8]), а также бессимптомного течения инфекции.

About the authors

Kh. F Fam

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Moscow, Russia

E. A Borovikova

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Moscow, Russia

A. V Sidorov

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Moscow, Russia

A. V Karataeva

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Moscow, Russia

T. P Antonova

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Moscow, Russia

V. V Zverev

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Moscow, Russia

References

Supplementary files