Competitive ability of Escherichia coli strains in the intestinal microbiota of patients with Crohn's disease and healthy volunteers: physiological, biochemical and genetic characteristics

Full Text

Введение

Желудочно-кишечный тракт человека содержит таксономически и функционально сложную микробную экосистему [1]. Микроорганизмы, заселяющие кишечник, находятся в разнообразных взаимоотношениях как с макроорганизмом, так и между собой [2]. В условиях ограниченного пространства кишечника преимуществом обладают микроорганизмы, способные использовать одно или несколько питательных веществ более эффективно, чем его конкуренты [3]. У комменсалов развились различные механизмы, позволяющие им выживать и успешно колонизировать кишечник [4]. При конкуренции за использование ресурса без прямого взаимодействия между конкурентами организмы секретируют специализированные метаболиты, такие как бактериоцины [5], нацеленные, как правило, на близкородственные организмы. При прямом контактном взаимодействии важную роль играют системы, которым не нужны специфические мишени, — система контактзависимого ингибирования (contact-dependent growth inhibition — CDI) [6, 7] и система секреции 6-го типа (type 6 secretion system — T6SS) [8, 9]. Показано, что конкурентное вытеснение комменсалами микроорганизмов обеспечивает колонизационную резистентность кишечника и защиту организма хозяина от патогенных микроорганизмов [10–12]. Однако нарушение гомеостаза под действием различных факторов (приём антибиотиков, бактериальная или вирусная инфекция, нарушения иммунной системы) могут приводить к дисбалансу, сопровождающемуся снижением разнообразия и сменой занимаемых экологических ниш бактериями, вызывая различные патологические процессы в кишечнике [13, 14].

Болезнь Крона (БК) — хроническое воспаление различных отделов желудочно-кишечного тракта, прогрессирующее с течением времени и характеризующееся чередой обострений и ремиссий [15, 16]. БК сопровождается нарушениями микробиоты, в частности увеличением доли Escherichia coli, однако определённые причины данного явления не выявлены. В то же время кишечная палочка является важным компонентом микробиоты и заселяет кишечник человека в течение 1-го года жизни [17, 18]. Предполагают, что патогенные штаммы используют альтернативные источники питания и занимают ниши, не занятые комменсальными бактериями [19]. Кроме того, рассматривают возможность проявления комменсальными штаммами E. coli патогенных свойств [20], поскольку бактерии содержат генетические детерминанты (факторы вирулентности), которые не только помогают им адаптироваться к новым условиям окружающей среды, но и воздействовать на организм человека, вызывая патологические процессы [21].

Цель данной работы — характеристика конкурентных свойств штаммов E. coli, выделенных из кишечника пациентов с БК и здоровых добровольцев, а также выявление биохимических и генетических детерминант, лежащих в их основе.

Материалы и методы

Нами проанализированы 11 штаммов E. coli, продемонстрировавших ранее ингибирующую активность в отношении E. coli K-12 substr. MG1655 [22] и входящих в коллекцию из 63 штаммов, выделенных из кала 32 людей (14 пациентов с БК и 18 здоровых добровольцев) и охарактеризованных нами ранее [22, 23]. Образцы кала были собраны в Университетской клинике Казанского (Приволжского) федерального университета (Медико-санитарная часть). Все пациенты были проинформированы об участии в исследовании и дали своё согласие. Исследование было рассмотрено и одобрено локальным этическим комитетом Казанского (Приволжского) федерального университета (протокол № 6 от 13.10.2017).

Для оценки антагонистической активности использовали представителей семейства Enterobacteriaceae — изоляты Enterobacter cloacae 3_222_2 и Klebsiella pneumonia 3_219_1, выделенные из кала пациентов с БК, а также культуру Salmonella enterica, предоставленную сотрудниками Республиканской клинической инфекционной больницы им. проф. А.Ф. Агафонова (Казань, Россия). Антагонистическую активность оценивали на плотной питательной среде согласно [24] с некоторыми модификациями. Для этого тестовую культуру бактерий смешивали с расплавленным 0,8% LB-агаром, наносили на 2% LB-агар и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре до полного затвердения. По 3 мкл исходной культуры каждого штамма E. coli (OD600 = 1,0) и её разведений в 10 и 100 раз наносили на подготовленные чашки с тестовой культурой и инкубировали в течение ночи при 37°C. Эксперимент проводили в 2 повторах. Активность считали антагонистической при размере зон задержки роста тестовой культуры более 1 мм (рис. 1).

 

Рис. 1. Оценка антагонистической активности исследуемых штаммов E. coli на примере совместного культивирования с E. coli K-12 substr. MG1655. / Fig. 1. E. coli antagonistic activity evaluation using co-cultivation with E. coli K-12 substr. MG1655 as an example.

 

Биохимические реакции проводили с использованием коммерческого набора «ENTEROtest 24 N» («Lachema»), представляющего собой планшет с субстратами для определения утилизации аргинина, орнитина, лизина, малоната, салицина, сорбитола, мелибиозы, целлобиозы, лактозы, трегалозы, маннитола, дульцита, адонитола, арабитола, сахарозы, инозитола, раффинозы и эскулина, роста на цитрате Симмонса, наличия β-галактозидазы, β-глюкуронидазы, β-ксилоксидазы, уреазной активности и продукции сероводорода.

Штаммы E. cloacae и K. pneumonia выделены нами из образцов фекалий пациентов с БК и являются потенциальными конкурентами E. coli в микробиоте кишечника. S. enterica служит причиной кишечных расстройств и опасна для здоровья человека. Интерпретация результатов теста по активности штаммов пациентов и здоровых людей затруднена ввиду большого разнообразия обнаруженных генов бактериоцинов у E. coli и непредсказуемого влияния их друг на друга. Поэтому для оценки был использован модельный лабораторный штамм E. coli К-12 substr. MG1655.

Поиск генов, кодирующих ферменты продукции бактериоцинов и колибактина, а также T6SS и CDI в геномах штаммов E. coli проводили путём выравнивания на нуклеотидные последовательности референсных генов с использованием BLASTn (идентичность не менее 80%, длина гена более 80%, E < 10^–16). Поиск нуклеотидных замен в гене fimH (адгезин) исследуемых штаммов проводили путём множественного выравнивания с использованием Clustal Omega¹. Последовательность гена fimH штамма E. coli K-12 substr. MG1655 была взята в качестве референсной. Последовательности полных геномов 63 штаммов, выделенных из образцов кала 32 людей (14 пациентов с БК и 18 здоровых добровольцев), загружены в NCBI (проект PRJNA560176).

Для филогенетического анализа последовательности геномов были загружены на платформу Type (Strain) Genome Server² [25]. При построении дерева использовали референсные геномы E. coli K-12 substr. MG1655 (GCF_904425475.1), E. coli Nissle 1917 (GCF_003546975.1), Salmonella enterica subsp. enterica str. 92-0392 (GCF_002761055.1), Enterobacter cloacae GGT036 (GCF_000770155.1), Klebsiella pneumonia subsp. pneumoniae str. HS11286 (GCF_000240185.1), доступные в базе данных NCBI³. Попарные сравнения всех геномных последовательностей производили с использованием метода Genome BLAST Distance Phylogeny (GBDP) и оценки точных межгеномных расстояний, подсчитанных с помощью алгоритма «trimming» и формулы расстояния d5 [26]. Полученные межгеномные расстояния были использованы для построения минимального дерева эволюции с поддержкой ветвей (с использованием 100 pseudo-bootstrap повторов) с по- мощью программы FASTME 2.1.6.1 [27]. Филограмма была визуализирована с помощью PhyD3 [28].

Статистический анализ частоты встречаемости биохимических свойств и генов бактериоцинов проводили с помощью точного критерия Фишера; р < 0,05 принимали за уровень статистической достоверности.

Результаты и обсуждение

По результатам первичного скрининга 63 штам- мов [22] антагонистическую активность в отношении лабораторного штамма E. coli K-12 substr. MG1655 проявили 11 штаммов: 4 — от пациентов с БК и 7 — от здоровых добровольцев (p > 0,05, точный критерий Фишера). В настоящей работе в качестве модели межвидовой конкуренции было проведено совместное культивирование данных штаммов с бактериями E. cloacae, K. pneumonia и S. enterica. Антагонистическую активность в отношении всех протестированных культур энтеробактерий проявили только штаммы, выделенные из фекалий здоровых добровольцев (табл. 1). В отношении E. cloacae были активны штаммы 1_34_12 и 1_45_11, рост K. pneumonia и S. enterica подавляли штаммы 1_39_1 и 1_45_11. Таким образом, были отобраны 3 штамма E. coli от здоровых добровольцев, проявившие способность вытеснять конкурентные микроорганизмы in vitro.

 

Таблица 1. Антагонистическая активность 11 штаммов E. coli в отношении представителей семейства Enterobacteriaceae / Table 1. Antagonistic activity of 11 E. coli strains against other members of Enterobacteriaceae family

Конкурентный штамм Competitive strain	Штамм E. coli | E. coli strain
	1_18_1	1_25_1	1_25_14	1_34_12	1_39_1	1_45_11	36k_8	3_77_1	3_188_1	3_200_11	3_225_1
Enterobacter cloacae	–	–	–	+	–	+	–	–	–	–	–
Klebsiella pneumonia	–	–	–	–	+	+	–	–	–	–	–
Salmonella enterica	–	–	–	–	+	+	–	–	–	–	–

 

Микробиота кишечника в значительной степени детерминирована спектром питательных веществ, зависящих от диеты хозяина [29]. В ряде работ продемонстрированы различия в структуре микробиоты кишечника сельских и городских жителей [30, 31]. Питательные вещества в кишечнике варьируют во времени и пространстве [32], поэтому метаболическая гибкость и способность использовать разные субстраты являются важными стратегиями для выживания бактерий в условиях постоянных колебаний состава питательных веществ [33]. По результатам анализа биохимических свойств не выявлено статистически значимых различий в способности утилизировать субстраты среди штаммов от пациентов с БК и здоровых добровольцев. В обеих группах присутствовали штаммы, утилизирующие адонитол и арабитол, но не способные утилизировать лактозу. Данные биохимические свойства являются редкими для E. coli и встречаются у 5% представителей вида согласно определителю бактерий Берджи [34]. Стоит отметить, что три штамма, способные подавлять рост E. cloacae, K. pneumonia и/или S. enterica, обладают типичными биохимическими свойствами, характерными для вида E. coli. Штаммы 1_45_11 и 1_34_12 способны ферментировать сорбит, лактозу, маннит, мелибиозу, трегалозу, а также обладают β-галактозидазной и β-глюкуронидазной активностью и содержат аргининдигидролазу и лизиндекарбоксилазу (рис. 2). Штамм 1_39_1, кроме того, способен утилизировать орнитин.

 

Рис. 2. Биохимические свойства клинических штаммов E. coli, проявивших антагонистическую активность в отношении представителей семейства Enterobacteriaceae.*Штаммы от пациентов с БК. E. coli K-12 substr. MG1655 — контрольный штамм. / Fig. 2. Biochemical properties of clinical E. coli strains showing antagonistic activity against Enterobacteriaceae. *Strains from patients with Crohn’s disease. E. coli K-12 substr. MG1655 is a control strain.

 

Согласно результатам подсчёта КОЕ, 8 из 11 штаммов доминируют в микробном сообществе кишечника участников исследования (табл. 2). Минорную долю в кишечном сообществе составляют штаммы 1_25_14 и 3_200_11, что, вероятно, связано с неспособностью утилизировать данными штаммами лактозу, являющуюся важнейшим источником углерода для E. coli [34], а также штамм 3_225_1, который, как и штамм 3_200_11, не утилизирует мелибиозу. Можно предположить, что мелибиоза даёт конкурентное преимущество бактериям при колонизации кишечника.

 

Таблица 2. Доля штаммов, проявивших антагонистическую активность в отношении E. coli К-12, в кишечном сообществе участников исследования / Table 2. The proportion of strains that showed antagonistic activity against E. coli K-12 in the intestinal community of study participants

Штамм E. coli | E. coli strain	Источник выделения штамма | Source of strain isolation	Доля в сообществе, % Proportion in the community, %
1_18_1	Здоровый доброволец | Healthy volunteer	96
1_25_1	Здоровый доброволец | Healthy volunteer	97,3
1_25_14	Здоровый доброволец | Healthy volunteer	0,8
1_34_12	Здоровый доброволец | Healthy volunteer	79,5
1_39_1	Здоровый доброволец | Healthy volunteer	95
1_45_11	Здоровый доброволец | Healthy volunteer	84,5
36k_8	Здоровый доброволец | Healthy volunteer	84,7
3_77_1	Пациент с БК | CD patient	100
3_188_1	Пациент с БК | CD patient	100
3_200_11	Пациент с БК | CD patient	24
3_225_1	Пациент с БК | CD patient	16

 

В ходе анализа геномов у всех конкурентных штаммов обнаружены гены систем продукции бактериоцинов, дающих внутри- и межвидовое конкурентное преимущество при колонизации кишечника [5, 35] (табл. 3). Геномы штаммов пациентов с БК содержат полные кластеры генов продукции микроцинов J25 (штамм 3_77_1) и H47 (штамм 3_188_1), а также гены, необходимые для продукции колицинов А (штамм 3_200_11) и К (штамм 3_225_1). Штаммы здоровых добровольцев содержат полные кластеры генов продукции микроцинов С7 (штамм 1_39_1), В17 (штамм 36к_8), J25 (штамм 36к_8), H47 (штаммы 1_34_12, 1_39_1, 36к_8) и М (штамм 1_34_12), а также колицинов А (штаммы 1_25_1, 1_25_14, 1_34_12), В (штамм 3_77_1), Е1 (штамм 1_45_11), Ia (штамм 1_45_11), Ib (штамм 1_45_11), К (штамм 1_18_1) и М (штамм 1_45_11). Микроцин J25 неэффективен в отношении E. cloacae, K. pneumonia и S. enterica [36]. Кроме того, синтез микроцинов J25, I47 и H47 ингибируется в условиях культивирования на богатой питательной среде [37, 38], а синтез микроцина В17 индуцируется в условиях азотного голодания [39], что может объяснять неспособность штаммов 36к_8, 3_77_1 и 3_188_1, содержащих данные системы, подавлять рост E. cloacae, K. pneumonia и S. enterica. Таким образом, можно предположить, что активность штамма 1_39_1 в отношении K. pneumonia и S. enterica связана с кластером генов продукции микроцина С7, что соответствует данным литературы [40]. Способность штамма 1_34_12 ингибировать рост E. cloacae может быть опосредована системой продукции микроцина М. Интересно, что штамм 1_45_11 не содержит систем продукции микроцинов, однако ингибирует рост S. enterica, что, вероятно, связано с наличием у него генов колицинов Ia, Ib и M, которые, согласно данным литературы, эффективны в отношении сальмонелл [41]. Кроме того, в недавнем исследовании показано, что E. coli, содержащие гены продукции данных колицинов, подавляют рост S. enterica и K. pneumoniae [42].

 

Таблица 3. Гены систем продукции бактериоцинов, обнаруженные у 11 штаммов E. coli, проявивших антагонистическую активность в отношении представителей семейства Enterobacteriaceae / Table 3. Genes for bacteriocin production systems found in E. coli strains that showed antagonistic activity against Enterobacteriaceae

Фактор Bacteriocin

Ген Gene

Функция Function

Штаммы E. coli | E. coli strain

от здоровых добровольцев from healthy individuals

от пациентов с БК from patients with CD

1_34_12

1_39_1

1_45_11

1_18_1

1_25_1

1_25_14

36k_8

3_77_1

3_188_1

3_200_11

3_225_1

Колицин | Colicin

A

caa

Колицин A (неполный) | Colicin A (incomplete)

+

–

–

–

+

+

–

–

+

+

–

cai

Иммунитет к колицину | Colicin А immunity

+

–

+

–

+

+

–

+

+

+

–

B

cba

Колицин B | Colicin B

–

–

+

–

–

–

–

+

–

–

–

cbi

Иммунитет к колицину | Colicin B immunity

–

–

+

–

–

–

–

+

–

–

–

E1

cea

Колицин E1 | Colicin E1

–

–

+

–

–

–

–

–

–

–

–

imm

Иммунитет к колицину | Colicin E1 immunity

–

–

+

–

–

–

–

–

–

–

–

lys

Белок лизиса | Lysis

–

–

+

–

–

–

–

–

–

–

–

Ia

cia

Колицин Ia | Colicin Ia

–

–

+

–

–

–

–

–

–

–

–

iia, imm

Иммунитет к колицину | Colicin Ia immunity

–

–

+

–

–

–

–

–

–

–

–

Ib

cib

Колицин Ib | Colicin Ib

–

–

+

–

–

–

–

–

–

–

–

Иммунитет к колицину | Colicin Ib immunity

+

–

+

–

+

–

–

–

+

–

K

cka

Колицин K | Colicin K

–

–

–

+

–

–

–

–

–

–

+

cki

Иммунитет к колицину | Colicin K immunity

–

–

–

+

–

–

–

–

–

–

+

ckl

Белок лизиса | Lysis

–

–

–

+

–

–

–

–

–

–

+

M

cma

Колицин M | Colicin M

–

–

+

–

–

–

–

+

–

–

–

cmi

Иммунитет к колицину | Colicin M immunity

–

–

+

–

–

–

–

+

–

–

–

Микроцин | Microcin

Класс I | Class I

B17

mcbA

Микроцин B17 | Microcin B17

–

–

–

–

–

–

+

–

–

–

–

mcbG

Иммунитет к микроцину | Self-immunity

–

–

–

+

+

–

+

–

–

–

–

mcbF

Иммунитет к микроцину | Self-immunity

–

–

–

–

–

–

+

–

–

–

–

mcbE

Иммунитет к микроцину | Self-immunity

–

–

–

–

–

–

+

–

–

–

–

mcbD

Процессинг микроцина | Processing

–

–

–

–

–

–

+

–

–

–

–

mcbC

Процессинг микроцина | Processing

–

–

–

–

–

–

+

–

–

–

–

mcbB

Процессинг микроцина | Processing

–

–

–

–

–

–

+

–

–

–

–

C7

mccA

Микроцин C7 | Microcin C7

–

+

–

–

–

–

–

–

–

–

–

mccF

Иммунитет к микроцину | Self-immunity

–

+

–

–

–

–

–

–

–

–

–

mccD

Посттрансляционные модификации Post-translation modifications

–

+

–

–

–

–

–

–

–

–

–

mccC

Экспорт микроцина | Export

–

+

–

–

–

–

–

–

–

–

–

mccE

Посттрансляционные модификации Post-translation modifications

–

+

–

–

–

–

–

–

–

–

–

mccB

Посттрансляционные модификации Post-translation modifications

–

+

–

–

–

–

–

–

–

–

–

J25

mcjA

Микроцин J25 | Microcin J25

–

–

–

–

–

–

+

+

–

–

–

mcjD

Экспорт микроцина, иммунитет Export, self-immunity

–

–

–

–

–

–

+

+

–

–

–

Фактор Bacteriocin

Ген Gene

Функция Function

Штаммы E. coli | E. coli strain

от здоровых добровольцев from healthy individuals

от пациентов с БК from patients with CD

1_34_12

1_39_1

1_45_11

1_18_1

1_25_1

1_25_14

36k_8

3_77_1

3_188_1

3_200_11

3_225_1

mcjB

Процессинг микроцина | Processing

–

–

–

–

–

–

+

+

–

–

–

mcjC

Процессинг микроцина | Processing

–

–

–

–

–

–

+

+

–

–

–

Класс IIa | Class IIa

V

cvaC

Колицин V | Colicin V

+

+

–

–

–

–

+

+

–

–

–

cvi

Иммунитет к колицину | Self-immunity

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

cvaB

Синтез колицина | Synthesis

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

cvaA

Секреция колицина | Secretion

–

–

–

–

–

–

+

+

+

–

–

Класс IIb | Class IIb

H47

mchB

Предшественник микроцина H47 Microcin H47 precursor

+

+

–

–

–

–

+

–

+

–

–

mchC

Процессинг микроцина | Processing

+

+

–

–

–

–

+

–

+

–

–

mchD

Посттрансляционные модификации Post-translation modifications

+

+

–

–

–

–

+

–

+

–

–

mchE

Секреция микроцина | Secretion

+

+

–

–

–

–

+

–

+

–

–

mchF

Секреция микроцина | Secretion

+

+

–

–

–

–

+

–

+

–

–

mchX

Регуляции экспресии микроцина Regulation of expression

+

+

–

–

–

–

+

–

+

–

–

mchI

Иммунитет к микроцину | Self-immunity

+

+

–

–

–

–

+

–

+

–

–

I47

mchS2

Предшественник микроцина I47 Microcin I47 precursor

+

–

–

–

–

–

+

–

+

–

–

mchS3

Белок иммунитета к микроцину Self-immunity

+

–

–

–

–

–

+

–

+

–

–

mchS4

Регуляция экспрессии микроцина Regulation of expression

+

+

–

–

–

–

+

–

+

–

–

M

mcmA

Предшественник микроцина M Microcin M precursor

+

+

–

–

–

–

–

–

–

–

–

mcmI/ mcmA

Иммунитет к микроцину | Self-immunity

+

+

–

–

–

–

–

–

–

–

–

mcmK

Посттрансляционные модификации Post-translation modifications

+

–

–

–

–

–

+

–

+

–

–

mcmL

Посттрансляционные модификации Post-translation modifications

+

–

–

–

–

–

+

–

+

–

–

mcmM

Процессинг микроцина и экспорт Processing and export

+

+

–

–

–

–

+

–

+

–

–

 

Геномный анализ показал, что ни один из 11 штаммов не несёт кластеры генов систем прямого контактного взаимодействия CDI [7], а кластеры генов T6SS [43] обнаружены только в 1 штамме от здорового добровольца (36k_8). Поскольку данный штамм не содержит гены колицинов, а имеющиеся кластеры продукции микроцинов (В17, H47) неактивны на богатой питательной среде, использованной в исследовании, можно предположить, что конкуренция штамма с другими бактериями опосредована T6SS. Однако связь генов продукции бактериоцинов и T6SS с антагонистической активностью требует дальнейшего подтверждения путём оценки экспрессии генов обнаруженных систем либо путём детекции конечного продукта.

Среди других факторов, ассоциированных с выживанием бактерий в сообществе, только у штамма 1_39_1 обнаружен кластер генов pks, необходимый для биосинтеза и транспорта колибактина — вторичного метаболита, описанного преимущественно для патогенных штаммов семейства Enterobacteriaceae [44–46] и индуцирующего двуцепочечные разрывы ДНК в эукариотических клетках [47]. Однако инактивация гена clbA pks-острова в геноме пробиотического штамма E. coli Nissle 1917 приводит к существенному ослаблению его терапевтических свойств [48].

Для оценки адгезивного потенциала 11 штаммов были изучены варианты гена адгезина fimH, способствующего прикреплению бактериальной клетки к эпителиоцитам, поскольку некоторые точечные мутации в гене fimH (G73A/E/R/W, T158A/P, R166C/H/S) ассоциированы с фенотипической адгезией бактерий [49]. Среди всех штаммов только в гене fimH штамма 1_39_1 была обнаружена замена R166C/H, дающая конкурентное преимущество при колонизации кишечника.

Проведён филогенетический анализ штаммов, подавляющих рост нескольких протестированных представителей семейства Enterobacteriaceae. Оказалось, что штаммы 1_34_12 и 1_45_11 филогенетически близки лабораторному штамму K-12 substr. MG1655, а штамм 1_39_1 родственен известному пробиотическому штамму Nissle 1917 (рис. 3).

 

Рис. 3. Филограмма, построенная с помощью расстояний GBDP, рассчитанных на основе геномных последовательностей. Цифры представляют собой значения поддержки pseudo-bootstrap GBDP > 60% из 100 повторов при средней поддержке ветвей 62,2%. / Fig. 3. Phylogram constructed using the GBDP distances calculated from genomic sequences. Values in tree nodes represent pseudo-bootstrap GBDP support > 60% out of 100 repeats, with an average branch support of 62.2%.

 

Таким образом, в настоящем исследовании был проведён анализ микробных взаимодействий 11 клинических штаммов (4 от пациентов с БК и 7 от здоровых добровольцев) с некоторыми представителями семейства Enterobacteriaceae. В отличие от штаммов здоровых добровольцев, штаммы пациентов с БК не проявили антагонистической активности в отношении E. cloacae, K. pneumonia и S. enterica, несмотря на то что содержат гены, необходимые для продукции некоторых бактериоцинов, что, вероятно, связано с особенностями метода проведения анализа. Гены систем продукции бактериоцинов являются важными факторами колонизации кишечника бактерий и связаны с их пробиотическими свойствами [50]. В то же время данные кластеры генов обнаружены в геномах патогенных штаммов [5, 51], а также у пациентов с БК [51], что было подтверждено в данном исследовании. Штаммы здоровых добровольцев, проявившие антагонистическую активность, содержат не только гены систем продукции бактериоцинов, но и T6SS, осуществляющих прямое контактное взаимодействие между бактериями. Кроме того, выявлены 3 штамма (1_34_12, 1_39_1 и 1_45_11), способные подавлять рост нескольких протестированных представителей энтеробактерий. Данные штаммы обладают высоким конкурентным потенциалом и, вероятно, играют важную роль в колонизационной резистентности кишечника. Среди штаммов 1_34_12 и 1_45_11, филогенетически родственных штамму K-12 substr. MG1655, наибольший интерес представляет штамм 1_45_11, способный подавлять рост всех протестированных представителей энтеробактерий. Штамм 1_39_1, проявивший антагонистическую активность в отношении K. pneumonia и S. enterica, оказался филогенетически родственным известному пробиотическому штамму Nissle 1917. Кроме того, он содержит мутацию в гене адгезина fimH, повышающую адгезивную способность бактерий, и кластер генов системы продукции колибактина, обнаруженный ранее у Nissle 1917 [48].

Заключение

На примере E. coli были продемонстрированы различия в конкурентном потенциале 11 филогенетически родственных штаммов, заселяющих кишечник пациентов с БК и здоровых добровольцев. Интересно, что способность вытеснять in vitro несколько представителей конкурентных энтеробактерий была обнаружена у штаммов, выделенных у здоровых добровольцев. Вероятно, данные штаммы обладают важными свойствами, необходимыми для обеспечения колонизационной резистентности кишечника человека. Анализ биохимических характеристик не продемонстрировал различий в способности утилизировать субстраты среди E. coli пациентов и здоровых добровольцев, однако выявил свойства, отсутствующие у минорной группы штаммов и, вероятно, необходимые бактериям для успешной конкуренции в сообществе. Кроме того, в обеих группах были идентифицированы редко встречающиеся среди кишечных палочек штаммы. Интересно, что высококонкурентные штаммы не обладают уникальными особенностями, которые могли бы давать штаммам преимущество при колонизации кишечника. Сравнительный геномный анализ позволил выявить генетические детерминанты, дающие конкурентные преимущества бактериям обеих исследованных групп, а также выявить некоторые характеристики геномов штаммов здоровых добровольцев, обладающих высоким конкурентным потенциалом. Для понимания роли E. coli в поддержании кишечного гомеостаза и развитии воспалительных реакций желудочно-кишечного тракта необходимо дальнейшее изучение комплекса взаимодействий штаммов друг с другом и с организмом хозяина.

 

¹ URL: https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/

² URL: https://tygs.dsmz.de

³ URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ (дата обращения: 01.07.2021).

About the authors

Maria N. Siniagina

Kazan Federal University

Author for correspondence.
Email: marias25@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-8138-9235

researcher, Research laboratory “Omics technologies”

Russian Federation, Kazan

Alexander V. Laikov

Kazan Federal University

Email: marias25@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-4250-2645

researcher, Research laboratory “Omics technologies”, Institute of Fundamental Medicine and Biology

Russian Federation, Kazan

Maria I. Markelova

Kazan Federal University

Email: marias25@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-7445-2091

researcher, Research laboratory “Omics technologies”, Institute of Fundamental Medicine and Biology

Russian Federation, Kazan

Eugenia A. Boulygina

Kazan Federal University

Email: marias25@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-3458-1176

researcher, Research laboratory “Omics technologies”, Institute of Fundamental Medicine and Biology

Russian Federation, Kazan

Dilyara R. Khusnutdinova

Kazan Federal University

Email: marias25@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-9982-9059

researcher, Research laboratory “Omics technologies”, Institute of Fundamental Medicine and Biology

Russian Federation, Kazan

Sayar R. Abdulkhakov

Kazan Federal University

Email: marias25@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-9542-3580

Cand. Sci. (Med.), Head, Department of fundamentals of clinical medicine, senior researcher, Research laboratory “Omics technologies”, Institute of Fundamental Medicine and Biology

Russian Federation, Kazan

Tatyana V. Grigoryeva

Kazan Federal University

Email: marias25@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-5314-7012

Cand. Sci. (Biol.), senior researcher, Research laboratory “Omics technologies”, Institute of Fundamental Medicine and Biology

Russian Federation, Kazan

References

Supplementary files